Organ-on-a-chipの結果分析

//結果分析//ーー
Organ-on-a-chipは複雑で、多くの労力を必要とします。
最大で28日程度の長い実験時間が必要です。
Organ-on-a-chipから最大限の情報を得るためには
オフラインとその場観察(in situ)の両方の分析が必要です。
結果を評価するときには
〇生理学、測定のタイムスケールの関係
〇システム、臓器レベルの空間分解能
〇測定が定量的か、定性的か
これらを考慮する必要があります。
生物学的な反応と測定を合わせる事は重要です。
例えば、
心臓の伝導速度は数秒単位です。
一方、細胞の運動性は数時間かかります。
神経ネットワークではミリ秒以下です。
多臓器システムでは
様々な臓器特異的、かつ局所的な出力を
同時にモニターすることは全体を理解する事につながります。
例えば、薬剤の働きを評価するときには
標的臓器の効果と他の臓器の副作用の評価を
同時に行うことができます。

//オフライン、その場分析//ーー
Organ-on-a-chipの恒常性、反応を分析するために
複数の分子の間欠的な測定は望ましいです。
オフライン、高機能の
〇liquid chromatography/mass spectrometry (HPLC/MS)
〇multiplexed(bead-based)protein-binding/DNA-binding assays
これらは実用的な技術です。
同時に広範囲の異なる化学物質を測定する事ができます。
そのうちの多くはバイオマーカーとなります。
両方のオフラインの分析方法は
マイクロリットルの量で行うことができます。
これはワンパスの灌流で使われる流量と互換性を持ちます。
様々な商用のアッセイキットは
バイオマーカーの代替として使う事ができます。
例えば、肝臓のシステムに対して
〇albumin
〇lactate dehydrogenase
〇alanine amino transferase
〇aspartate aminotransferase
〇urea
これらです。
但し、血清などの媒体との相互作用は
注意深く考慮する必要があります。
浮遊物のオンライン、その場の測定は
最小の時間遅れで栄養物や代謝生成物を測定する事ができます。
小型のセンサーは
optical detection exploiting dyesに基づいて
使う事が出来ます(2)。
溶解酸素は代謝生成物の中で鍵となる因子で
特に肝臓のCYP450活性に関してはそうです(3-5)。
溶解酸素とpHは両方
マイクロプローブとpH-sensitiveパッチ
で調べることができます(6)。
光学検出は顕微鏡とファイバーを必要とします。
時間と労力を減らす自動技術が提案されています(7,8)。
グルコースや乳酸塩は
電気化学酵素ベースバイオセンサーによって
測定する事ができます(9,10)。

//機能評価//ーー
バイオマーカーは
〇薬剤、化粧品、食糧に対する身体の反応
〇化学物質への暴露
これらに関する重要な生物学的結果を与えます。
これは機能的な組織反応です。
理想的には
機能評価は非破壊で、その場観察が必要です。
特に長期間にわたり再循環が必要なシステムでは
求められます。
機能評価は反応に対して数秒以内の急速な情報を
提供しなければなりません。

//エンドポイント分析//ーー
Organ-on-a-chip内の細胞、遺伝子、タンパク質に対して
オンラインで有用なデータを得る事は難しいので
〇組織分析
〇溶解アッセイ
〇トランスクリプトーム
〇細胞運動アッセイ
などのエンドポイント分析をするために
装置を分解する必要があるかもしれません(11,12)。
そのために分解しても
細胞、組織、表面状態がダメージを受けないような
設計にする必要があります。
免疫細胞、癌細胞のように循環する細胞は
液体媒質からサンプリングします(13)。
しかしながら、
多くのマイクロ流体デバイスでは
実験の間に循環細胞が壊れてしまいます。
流体ダイナミクスはデバイスをデザインする間に
考慮される必要があります。
損傷なく細胞を抜き取る技術は難しく
それをするためには専門性が必要です。

//顕微鏡//ーー
顕微鏡は細胞生物学では
分析のために共通的に使われる方法です。
ほとんどのOrgan-on-a-chipは
ガラス、PDMS、サーモプラスチック。
これらのように透明であり、
イメージ深さよりも薄く形成されています。
従って、顕微鏡による分析が可能です。
細胞は蛍光染色、抗体などによって
光学的に可視化できるようにします(14)。
--
〇共焦点顕微鏡法
〇light-sheet顕微鏡法
〇イメージサンプル準備手順
 (クリアリング、染色など)
これらを含む顕微鏡技術は顕著に向上しています。
また複雑で、3次元の対象物も扱うことができます。
高含量イメージングは
細胞と組織の表面状態の時空間情報を提供します。
これは病態生理学を明らかにし
新たな治療を評価する上で助けとなります。
Organ-on-a-chipは顕微鏡の空間分解能を
守るためにマイクロステージに設置できるように
しておく必要があります。
上述したイメージサンプルの準備手順他に
イメージを分析するツールも必要です(15)。
画像分析は機械学習アルゴリズムが
有効なツールとされています。
例えば、
deep learning convolutional neural networks 
これを使って、癌組織の回転楕円体を
非侵襲で画像化する事が可能です(16)。

//経上皮電気抵抗//ーー
経上皮電気抵抗は
〇胃腸
〇腎臓
〇血液脳関門
これらなどのバリアの健全性と浸透性を評価する
ための共通的な方法です。
血液脳関門でタイトで健全な組織では
おおおそ1500～1800Ω/cm^2(17)。
一方、
腎臓の近位尿細管では70Ω/cm^2(18)。
これらです。
Organ-on-a-chipの組織、臓器では
生理学的に正しい値を示さなければなりません。
--
経上皮電気抵抗は
オーム法則手法、インピーダンス分光法
これらがあります。
マイクロ電極がつけられるか？
組織に埋め込まれるか？
どちらかです(19-22)。
インピーダンス分光法はフィッチングアルゴリズムがあり
オーム法則手法よりも正確ですが、
オーム法則手法は手順が単純です。
インピーダンス分光法は組織の大きさと健全性を
測ることができます(23)。
電極は正確に設置する必要があります。
また組織全体に電流が均一に流れる必要があります。

//微小電極アレイとカンチレバー//ーー
微小電極アレイは細胞や組織の電気的活性を測る方法です。
カンチレバーは機械的な力を測る方法です(24,25)。
例えば、
微小電極アレイは伝導速度、ビート頻度、
電場電位時間(QTインターバル)
これらを測ることができます(26)。
これは
〇心臓
〇神経筋接合部
〇骨格筋収縮
〇神経システム
これらに適用できます(27-30)。
例えば、神経のプレ-ポストシナプス信号を
測ることができます(31)。
細胞や組織の収縮の力はカンチレバーのたわみに
よって測ることができます。
測定したい検体をパターン化して
カンチレバーのたわみを光学的、電気的に分析する
ことによってその力を定量化します(32,33)。
前述した経上皮電気抵抗と微小電極アレイ。
これらを組み合わせることもできます。
例えば、心臓で試されています(34)。

//まとめ//ーー
Organ-on-a-chipの培養条件、バイオマーカー
臓器の機能のリアルタイムのその場観察は
Organ-on-a-chipを改善するだけではなく
それで可能な実験の幅も広がります。

//考察//ーー
分析の精度を上げるためには
光学的、電気的、機械的にそれぞれ分析できるように
Organ-on-a-chipをデザインする事が
1つの考え方であると理解しています。
また、そもそも形成した組織が
生体内の実情と合っているかどうかも
分析の精度が上がれば、そのチェックができると考えます。

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