細胞外小胞のサブタイプ別、生成機序と分離法

細胞外小胞の生理、生物学を理解するためには
サブタイプごとの詳しいそれらを研究、調査する
必要があります。
また、それらを精製し、分離する技術も同様に
大切になります。
Lesley Cheng & Andrew F. Hill(敬称略)からなる
医療研究グループは
細胞外小胞のサブタイプである
エクソソーム、微小胞、アポトーシス小体について
上述した事に関連する詳しい情報を総括されています(1)。
その内容の一部、追記、考察について
読者の方と共有したいと思います。

//エクソソーム//ーー
小さな細胞外小胞の径は50-150nmで
"Classical" or "non-Classical" 
エクソソームの異種的な小胞を含みます。
Classicalエクソソームは
多胞体と呼ばれるエンドソーム後期課程の
膜を内側に陥入することで生じます。
細胞外への放出前では腔内膜小胞と呼ばれます。
このようなエンドソーム膜への陥入、胞形成、
加えて、主に細胞質に含まれる
タンパク質、核酸、脂質、代謝生成物などを
内包するための仕分けプロセスは
The endosomal sorting complex required for transport 
(ESCRT)と呼ばれます。
この複合体は
〇ESCRT-0 
hepatocyte receptor tyrosine kinase substrate (HRS)
also known as VPS27
〇ESCRT-I 
tumour susceptibility gene 101 (TSG101)
〇ESCRT-II (VPS25) 
〇ESCRT-III (CHMP4A, CHMP4B and CHMP4C) 
これらの4種類に分類されます(2)。
--
ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II。
これらはユビキチン化された物質を
認識して、エンドソームの内腔に輸送する役割があります。
ESCRT-IIのタンパク質は
ESCRT-IIIの形成を活性化させます。
この機能は付属タンパク質を引き寄せます。
付属タンパク質とは
〇ALG-2-interacting protein X(ALIX)
〇VPS4 
これらで腔内膜小胞の形成に関わります。
--
ESCRTのタイプごとの独立した生理経路は
多胞体の内側の萌芽を仲介します。
それは
〇スフィンゴミエリナーゼ加水分解
〇セラミド形成
(by 中性スフィンゴミエリナーゼ2(nSmase2))
これらを通して仲介します(3)。
上述したセラミドは腔内膜小胞を形成するための
多胞体膜の自発的な内側への湾曲(出芽)を誘発します。
--
多胞体は内腔に複数含んだ腔内膜小胞を
細胞膜と融合する事によって
腔内膜小胞をエクソソームとして
細胞外に放出します(4,5)。
この時、多胞体は細胞膜付近まで輸送される必要がありますが、
この移動は細胞質にあるアクチンによって駆動されます。
また細胞膜付近でエクソソームを分泌するためには
〇RAS関連タンパク質
RAB27A (RAB27A) and RAB27B。
これら両方が必要です。
--
多胞体が形成されている間に、
エクソソームの前駆体である腔内膜小胞は
〇エンドソームのタンパク質
〇細胞質のタンパク質
〇特異的なたんぱく質
〇核酸(RNA結合タンパク質など)
これら親細胞を反映した物質を取り込みます(6)。
腔内膜小胞の表面リガンドである
テトラスパニン(CD63)は
このような内容物を内腔に方向づけする役割があります。
テトラスパニンは細胞膜といくつかの細胞内小器官の
ルートを再利用する事に関連するタンパク質です(7,8)。
従って、物質の引き寄せに関わるタンパク質である
と考えられます。
--
径の小さなエクソソームは
100,000g(重力)の超遠心分離法によって
他の細胞外小胞であるアポトーシス小体、
微小胞と分離する事ができます。
その精製はさらに
ゾーン遠心分離法を利用する事ができます。
Optiprep gradientを通して小さな小胞を
分離する事ができます(9)。
--
小さな細胞が小胞の表面リガンドは
〇Tetraspanins (CD63, CD9 and CD81)
〇Membrane trafficking proteins
 (RAB proteins and annexins) 
〇Proteins involved in MVB formation
  (ALIX, TSG101 and clathrin)
これら機能的タンパク質を含みます(10)。
--
タンパク質を仕分けする機能を持つ
ESCRT経路は細胞外小胞を準備する過程で
検出する事が可能です
それによってエクソソームを分類する
信頼性が向上します(11,12)s。
--
エクソソームの典型的なマーカーは
テトラスパニンであるCD63, CD9, CD81。
これらです。
一方、冒頭で述べた"non-classical"な
エクソソームはテトラスパニンを発現していません(10)。

//微小胞//ーー
微小胞のサイズは150nm～1000nm以上で
平均的なサイズは250～400nmである
とされています(13,14)。
これは大きなサイズの細胞外小胞に分類されます。
微小胞は細胞膜を細胞質側から外側に出芽させる事によって
形成されます。切り離され、小胞となります。
この出芽する場所は細胞膜の特定の場所で起こります。
その場所はリン脂質の再分布の影響を受けます。
〇Rho-kinase-mediated myosin light chain phosphorylation
〇Contractile machinery 
これらは出芽した小胞の根元を挟んで、切り離す
過程に関係します(15,16)。
--
微小胞は親細胞の表面リガンドを反映した
脂質膜を典型的には形成すると考えられています。
内容物は
ribosomal RNA(rRNA)の切れ端
mRNAなどを含みます(17,18)。
--
微小胞は馴化培地、生体液から
アポトーシス小体と分離します。
その後、遠心分離機を使います。
--
微小胞は
透過型電子顕微鏡(TEM)
蛍光活性化細胞選別(FACS)
これらで検出、分析することができます。

//アポトーシス小体//ーー
アポトーシス小体は1～5μmの
最も大きなクラスの細胞外小胞です。
アポトーシスによって細胞死するときに
発芽、突き出しによって小胞が生じるとされています。
これら発芽、突き出し減少は
〇microtubule spikes(19)
〇apoptopodia(20)
〇beaded apoptopodia(21)
これらで定義されます。
--
内容物は
〇細胞内小器官(22)
〇細胞核のDNA(23,24)
〇核酸の破片
〇ランダムな取り込み(21)
これらを含みます。
--
アポトーシス小体はマクロファージに検知され
ファーゴサイトーシスによって取り込まれ、
除去されます(25)。
このファーゴサイトーシスは
〇CX3C-chemokine ligand 1 (CX3CL1)
〇intercellular adhesion molecule 3 (ICAM3) 
アポトーシス小体が持つこれらの
分子が関わっているとされています(26,27)。
--
アポトーシス小体は微小体とエクソソームに対して
大きさで分離する事ができます。
遠心分離機(2000g～4500g)で実施できます。
--
アポトーシス小体が血中で他の小胞に対して
どれくらいの比、また絶対数で含まれているかは
よくわかっていません。
しかし、アポトーシス小体は
〇癌生成の促進
〇細胞間のDNAの輸送(23,24)
〇炎症の促進(28)
これらの生理作用があるかもしれないと報告されています。

//考察//ーー
細胞外小胞は
出芽、胞形成、切り離し、内容物封入、細胞外放出、
それぞれに対して、
具体的に何らかの物質(生理)が関わっている事がわかります。
従って、その過程の一つ一つを人為的に制御することで
生成の促進、抑制を図る事ができる可能性があります。
例えば、
癌組織のエクソソームは癌生成に関わると言われています。
1つのキーとなる表面リガンドである
テトラスパニンの機能を物質を結合させることで
抑える事ができたら、エクソソームの生成を
抑制できるかもしれません。
このテトラスパニンは表面リガンドなので
細胞膜、エンドソーム膜、腔内膜小胞、
それぞれに含んでいる可能性があります。
薬剤でアクセスしやすい標的かもしれません。
実際に人パピローマウィルス、
サイトメガロウィルスの感染例で
テトラスパニンの機能を抑える研究があります(29)。
これは同時にエクソソームの形成を
抑える働きがあるかもしれません。

(参考文献)
(1)
Lesley Cheng & Andrew F. Hill
Therapeutically harnessing extracellular vesicles
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(2)
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Inhibition of Tetraspanin Functions Impairs Human Papillomavirus and Cytomegalovirus Infections
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