細胞外小胞の臨床応用とまとめ

細胞外小胞はバイオマーカーとして臨床応用できます。
病気によって、
核酸、タンパク質、脂質、グリカンなど
の物質が変わります。
それらの物質をバイオマーカーとして検出できます。
しかし、課題は
体液の膨大な量の細胞外小胞を含む小胞から
特定の組織、細胞から放出された細胞外小胞
そのサブタイプを識別する事です。
--
また、
細胞外小胞は核酸、タンパク質、薬剤の
輸送媒体としても利用できます。
その中での課題は
〇臨床グレードの質の高い特定の細胞外小胞を
　大量に分離すること
〇薬剤などを搭載すること
〇標的組織まで効率的に輸送すること
これらが挙げられています。
さらに
細胞外小胞は遺伝子編集のCRISPRの輸送媒体として
利用できます
--
Killian O’Brien, Koen Breyne(敬称略)らからなる
医療研究グループは細胞外小胞の
潜在的な臨床応用について総括されています(1)。
その内容の一部、追記、考察を
読者の方と情報共有したいと思います。

//バイオマーカー//ーー
細胞外小胞内に含まれるRNAsは
様々な疾患のバイオマーカーとして有効です(2)。
この細胞外小胞は様々な体液に含まれます。
〇血液
〇尿
〇唾液
〇脳脊髄液
〇母乳
これらなどです(3,4)。
--
細胞外小胞内のRNAsをバイオマーカーとして
利用する利点は、胞で包まれているため
体液中に含まれる核酸分解酵素による
分解を防ぐことができることにあります。
また、
細胞外小胞は親細胞の表面リガンドの情報を
引き継いでいるので、それを認識することで
どの細胞から放出された細胞外小胞か
識別する事ができるということです。
--
細胞外小胞内の特異的なRNA種の検出法として
〇Droplet Digital reverse transcription–PCR
これが挙げられています(5)。
--
細胞外小胞内のRNAsは様々な病態に応じて
各バイオタイプで改変が入ります。
例えば、以下です。
-
癌特異的なmRNA。
上皮成長因子受容体の変異を反映したmRNAであり
膠芽腫の患者さんの血液で検出されました(6)。
-
以下の疾患の特異的なmiRNAsが
脳脊髄液により検出されました。
〇膠芽腫(7)
〇アルツハイマー病(8)
〇パーキンソン病(8)
他には
〇乳癌(9)
これらです。
-
筋強直性ジストロフィーを持つ患者さんの
尿からmRNAスプライス変異の量の変化が
認められました(10)。
-
Ⅱ型糖尿病の患者さんの血液の
lncRNAプロファイルは
心臓の機能と相関がありました(11)。
--
現在、細胞外小胞と他の胞内の
変異mRNAsが以下の疾患の診断のバイオマーカー
として(以下のプログラムで)使われています。
〇血液の疾患(12)
(NeoLAB liquid biopsy from NeoGenomics Laboratories) 
〇前立腺、肺などの固形癌(13,14)
(ExoDx prostate test from Bio- Techne).

//治療用輸送媒体//--
細胞外小胞を治療用の輸送媒体として使用する
利点はいくつかあります。
〇様々な親細胞を選ぶことができる。
〇輸送物質を脂質膜で守ることができる。
〇表面リガンドを設計できる
〇RNA以外のタンパク質、脂質などの物質を輸送できる。
〇複数の積載物を同時に輸送できる。
これらが挙げられています(1)。
--
しかしながら、
これらの臨床応用は
〇細胞外小胞の異種性
〇特異的かつ精製された細胞外小胞を得るのが困難
これらのことから制限されています。
こうした中で
現在、臨床前試験では
様々な細胞外小胞の混合のなかで行われています(15,16)。
このような制限の中で
細胞外小胞を使ったRNA輸送に関して
臨床試験にすでに入っているものもあります(17)。
--
臨床前の結果では
改変を加えていない間葉系幹細胞由来の
細胞外小胞を静脈注射した結果、
体内に広範に分布し、
肝臓、脳、心臓、腎臓、肺、骨格筋、免疫システム
これらの様々疾患に効果があったことが
示されています(18-20)。
--
細胞外小胞は様々なドナーがあります。
〇間葉系幹細胞(21)
〇赤血球(22)
〇HEK293細胞(23)
〇牛乳(24)
〇人の血液(25)
〇グレープフルーツ(26)
〇ショウガ(25)
これらです。
自然にある物質であるので
臨床応用する際にFDAの厳格なガイドラインを
回避することができます(27)。
--
細胞外小胞は
生産性、封入効率、標的性を上げるために
特異的に設計することができます。
--
臨床前、臨床でテストされる5つのパターンがあります
①ドナー細胞を注入
②改変していない生成された細胞外小胞を注入
③標的性を上げるために改変した細胞外小胞の
　中に積載物を入れたものを試験管でテスト
④遺伝子的に改変した親細胞由来の
　標的性が向上し、積載物が多く含む細胞外小胞を注入
⑤生体内で改変された細胞外小胞を放出するための
　遺伝子的に改変した親細胞を注入
これらです(1)。
つまり、親細胞と細胞外小胞のどちらかを
注入するパターンがあります。
親細胞を入れる場合には、注入後
体内で特定の細胞外小胞が放出されることを狙いとしています。
また、細胞種特異的輸送系統(*)と関連する
標的性を上げるための手法は
直接的な結合による装飾と遺伝子導入によって
親細胞の表面リガンドを変えて
それを細胞外小胞に引き継がせるパターン
両方が考えられます。
上述したコンセプトが以下、様々なケースで
確かめられています。
(*)Cell-type-specific delivery system
--
小脳運動失調のための治療として
RNAsとタンパク質を含む
間葉系幹細胞由来の細胞外小胞が評価されています。
(NCT01649687)
同様に、骨の修復(28)、
目の再生のためにも評価されています(NCT03437759)。
--
miR-124を遺伝子導入した間葉系幹細胞由来の
細胞外小胞は、中枢神経系で豊富に表現される
miRNAを表現します。
それによって標的性が上がります。
また神経前駆細胞の分化と負の相関があります。
それを虚血性脳卒中のケースでテストしています。
(NCT03384433)
--
膵臓癌に対して、変異KRASに作用するmiRNAを
搭載した間葉系幹細胞由来の細胞外小胞が
テストされています(NCT03608631)。
--
huntingtin mRNAに対して
コレステロールと複合体化したsiRNAを
細胞外小胞に積載して遺伝子干渉させ
マウスのモデルでハンチントン病に関連する
タンパク質の量を減らすことに対して有効でした(29)。
--
骨髄間葉系細胞由来の細胞外小胞の表面に
骨を標的としたアパタマーを発現させました。
それによって骨組織を標的化できます。
骨粗しょう症の治療の為、マウスで実験されています(30)。
--
上述したように標的化ペプチドを発現させるために
親細胞に遺伝子導入して改変することができます。
それによって特定組織、細胞への標的性を高めます。
この改変方法を利用した例です。
ディジェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルで
筋組織を標的化するように設計して
スプライス制御のためのアンチセンスヌクレオチド。
これを積載しました。
これはジストロフィンを標的とします(31)。
他には
マウスのケースで膠芽腫の成長を抑えるために
miRNAが細胞外小胞に多く含まれるように
遺伝子改変した膠芽腫細胞を使用しています(32)。
加えて
HEK293T細胞に神経組織に標的性のあるリガンド形成のため
mRNAを遺伝子導入して、
そこから細胞外小胞の収量を向上させました。
それはエンドソームからの放出のための
表面リガンドも形成した事によって実現しました。
これはマウスのモデルで
パーキンソン病関連神経変性疾患において
皮下注射で効果が確認されました(33)。
--
合成された脂質ナノ粒子や遊離RNA分子治療に対して
細胞外小胞を治療の為の輸送媒体として使う利点は
〇低い免疫原性(34,35)
〇弱毒性(34,35)
〇細胞間、細胞浸透性(36,37)
〇組織障壁浸透性(36,37)
〇効率的な細胞への輸送(42)
〇積載物の保護
これらなどが挙げられています。
従って、オフターゲットを防ぎながら
特定の細胞までの輸送がより重要な
CRISPR Cas9への利用が期待されています。
それは細胞外小胞、
エクソソーム-リポソーム複合体
両方で想定されています(43,38)。
--
また細胞外小胞はワクチンとしての利用も想定されます。
癌の治療においては
樹状細胞由来の細胞外小胞を用いて
癌特異的なペプチドを輸送して
免疫原性の癌抗原を輸送する土台を作ります。
それを患者さんに投与します(39)。
--
新型コロナウィルス感染症mRNAワクチンのように
細胞外小胞のナノ粒子を輸送媒体として
mRNAを樹状細胞まで輸送する手法もあります(40)。
これは新型コロナウィルスなどの
感染症のためのワクチンとして利用できます。
免疫原性が低いならば、
脂質ナノ粒子を使った
現在のmRNAワクチンでアレルギー反応がでる
患者さんに投与できる可能性もあります。
--
癌ワクチンでは
樹状細胞由来の細胞外小胞を癌RNAと溶解物と
共に積載し、癌特異的抗原の豊富な資源を供給します(41)。
もう1つは
癌細胞由来に細胞外小胞を使って
樹状細胞の中で抗癌反応を得るというものです。
その場合、体内で得る場合と
注入前に樹状細胞に事前搭載して
その後、樹状細胞を投入する方法もあります。
--
現在、細胞外小胞の治療応用のために
多くの投資がされています。
アメリカ国立衛生研究所のような機関から
302の助成金があります。
またベンチャーからの助成もあります。

//まとめ//ーー
細胞外小胞はエクソソームを含めたサブクラスの分類
その中での大きさ、積載物の異種性などから
分析、治療の為の製造面、
両方で分離、精製して評価、作製する事が
それぞれ課題としてあります。
内容物のRNAに絞れば、
機能性が明らかではないRNAの破片も含まれ
それらも含めて理解を難しくしています。
臨床前、臨床試験でいくつかの成果が出ていますが、
"Secretomes"としての評価で
例えば、特性の揃ったエクソソームでの
評価ではない可能性があります。
細胞外小胞による治療の目指すところの一つは
特定の組織に精密に輸送する精密医療
あるいは個別化医療であると考えられるので
その上流のナノ粒子の特性を揃える必要性があります。
細胞外小胞に対する上述した精細な追求は
ナノ医療だけではなく、
基礎的な生理学、病理、病態の理解が
非常に幅広く進むことにもつながります。
細胞外小胞が原則的に全ての細胞から放出されているからです。

//細胞種特異的輸送系統の観点//ーー
細胞外小胞を使った標的化技術は
装飾因子に直接的に結合させる場合や
親細胞に遺伝子導入する場合など
幅広く考えられています。
これは脳の疾患であれば
脳に特異的に輸送する事を狙いとしています。
しかし、体内で何が起こっているか？
それが不明瞭な部分もあります。
標的化された細胞外小胞が
本当に効率的に標的組織、細胞まで輸送されているか？
それを
〇透明なゼブラフィッシュでの視覚的な確認
〇標的細胞種特異的な遊離遺伝子操作後の液体生検の確認
〇Organ-on-a-chip
などいくつかの角度で包括的に調べることが
最終的に得られる臨床結果を読み違えないために
重要になると考えられます。

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