細胞外小胞内へのRNA搭載、輸送のための改変

とりわけ治療目的で細胞外小胞に任意のRNAを
封入して、特異的な治療効果を実現しようとする場合、
〇細胞外小胞の親細胞の選択、
〇RNAの封入、
〇細胞外小胞の分泌量の制御、
これらの要因が大切になります。
--
Killian O’Brien(敬称略)ら医療研究グループは
これらの要因について
現在までわかっている事を総括されています(1)。
RNAの封入においては、
親細胞内で制御する場合において
有効な情報が多く含まれています。
本日は、その内容の一部、追記、考察について
読者の方と情報共有したいと思います。

//細胞外小胞の親細胞の選択//ーー
細胞外小胞内に任意のRNAを積載し、
特定の細胞種を標的化する事は
大きな治療機会を生みます。
このような細胞外小胞によるRNAの治療では
どの細胞種から生まれた細胞外小胞を使うか？
それが重要な因子です。
例えば
間葉系幹細胞からの細胞外小胞。
これは異なる組織からそれぞれ分離できます。
元々再生可能で、炎症性はないとされています(2,3)。
-
O型の赤血球細胞からの細胞外小胞。
これは積載物を搭載するのが容易とされています(4)。
-
樹状細胞からの細胞外小胞。
抗原を提示し、T細胞を活性化させるので
ワクチンとして使われることがあります(5,6)。
-
癌細胞からの細胞外小胞。
癌関連抗原を発現しているので、
それを通して抗癌免疫反応を誘発できますが、
一方で発がん性の要因も含みます(7)。

//細胞外小胞へのRNAの積載//ーー
細胞外小胞は大きさなどエンベロープ膜を持つ
ウィルスといくつかの類似点があります。
他にはRNAを輸送することも当てはまります。
コロナウィルスでは粒子系が125nm程度で
30kbの1本鎖のRNAを内包しているといわれています。
ここから、細胞外小胞から最大でどれくらいの
RNAを積載できるかを類推することができます。
しかし、細胞外小胞は
RNAの他にタンパク質、脂質、代謝生成物など
多様な物質を含んでいることがあるため
RNAの積載量を最大化するためには
他の積載物を取り除く必要があるかもしれません。

//RNAの効果的な封入と放出//ーー
RNAなど積載物を効果的に積載するために
内生的、外生的それぞれにおいて
ドナー細胞を改変することができます。
--
効果的に積載するために、
レンチウィルスの形質導入によって
親細胞内のRNAを過剰表現させることができます(8,9)。
細胞外小胞へのRNAの収量を上げるために
マイクロサイズの細孔を通じて
機械的に細胞外小胞を押し出すことによって
細胞から多くの細胞外小胞を取り出します(10)。
--
RNAを豊富に取り込むためには
ドナー細胞が以下の物質と相互作用をする
タンパク質を持つことによって達成できます。
〇細胞膜(11)
(ex. via different lipid anchors)
〇ウィルスエンベロープタンパク質(12)
(such as vesicular stomatitis virus glycoprotein)
〇遺伝子由来のRNA結合モチーフ(13)
(ex. the RNA-binding peptide from the MS2 bacteriophage coat protein)
--
RNAはタンパク質と複合体を作り
そのたんぱく質内のRNA結合モチーフによって
認識される特異的な配列を持ちます。
それが細胞膜と親和性を持ち
細胞膜から発芽を通じて放出されます。
これはレトロウィルス様の放出と類似します(11)。
--
RNAはエクソソームの前駆体を封入する
多胞体を標的とすることができます。
多胞体に豊富に含まれるたんぱく質と連結する
タンパク質を表現する事によって可能です。
例えば、
〇リソソーム関連膜タンパク質2
〇テトラスパニン
〇CD63
これらとRNA結合モチーフとの連結です(12,14)。
--
微小胞の中で
ARRDC1-mediated微小胞。
arrestin domain-containing protein 1(ARRDC1)。
これをRNAの選択的搭載のために
利用することができます。
このARRDC1とRNAが相互作用するようにエンジニアリングします。
例えば、
〇ARRDC1
 トランス活性化因子
 transcription (Tat) peptide from HIV 
〇RNA
 RNA結合モチーフ
 トランス活性化因子に反応する要素
これらを通じて相互作用させます。
これにより細胞外小胞に有効にRNAを搭載できます。
この手法はp53 mRNAの輸送で成功しました(15)。
--
他の手法では
〇zipcode'sequences
the 3′ untranslated region of the cargo RNA
これを特定のRNA結合タンパク質に認識させます。
これは多胞体標的タンパク質です(14)。
--
細胞外小胞の脂質構成要素を利用することで
RNAとRNA結合タンパク質を細胞外小胞に
効果的に搭載する事ができます。
その際にRNA結合タンパク質を
細胞外小胞の膜に結合するようにエンジニアします。
その時、脂質が曲がる部分の
脂質と結合する物質を選択します。
例えば
〇Annexin A5
〇MARCKS(38)
〇bradykinin(16)
これらです。
--
外生的にRNAを封入する方法として
電気穿孔法があります。
これは
〇siRNAs(17-21)
〇antisense oligonucleotides(22)
〇mRNAs(22)
に対して行われます。
他に超音波、 lipofectamineがあります(21,23)。
--
細胞外小胞に対して追加的にRNAを封入する場合は
すでに内容物が積載されている可能性を
考慮する必要があります。
また、
封入過程において抗原性や有害な物質が
細胞外小胞内に封入する可能性も考えられます。

//細胞外小胞の分泌量の制御//ーー
細胞外小胞を治療に生かすことを考えた時には
細胞外小胞を精製すること
またその量を制御する事が求められます。
細胞外小胞の分泌量を増やすことで
この小胞を使った製剤においての
スループットを上げる事ができます。
以下、細胞外小胞の分泌量を増加させる
物質、条件を列挙します。
--
〇STEAP3(14)
(involved in exosome biogenesis)
〇syndecan 4(14)
(MVB formation)
〇cortactin
(actin-bundling protein)
多胞体と細胞膜の融合を促進
〇bafilomycin A1(24)
癌細胞由来のエクソソーム分泌を促進。
〇heparanase(25)
癌細胞由来のエクソソーム分泌を促進。
〇monesin(Na+/H+ exchanger)(26)
細胞内のカルシウムイオンレベルを上げる。
〇serotonin(27)
マイクログリアにおいて
多胞体と細胞膜の融合を促進。
〇低酸素、酸化ストレス、低pH(28-31)
これらの条件は細胞外小胞分泌量を上げる
〇Vesicular stomatisウィルスタンパク質(32,33)
〇試験管での合成脂質との融合
　⇒細孔(100-400nm径)を通した突き出し(34)

細胞外小胞を分泌量増加の為
これらが挙げられています。
一方、逆に
癌などのケースにおいて細胞外小胞の分泌を
抑える事が治療効果がある場合もあります。
以下の物質が分泌量を下げます。
〇antihistamine drug ketotifen(35) 
〇antibiotic sulfisoxazole(36)
〇manumycin A(37)
〇tipifarnib(37)
〇neticonazole(37)
一方、分泌量を上げる物質は
〇sitafloxacin
〇chloroindole
〇fenoterol)
これらがあります(37)。
--
しかし、これら物質によってエクソソームを含む
細胞外小胞の分泌量を制御する事は
細胞外小胞の機能を変え、
有害性、免疫原性を上げる結果になる事も考えられます。
内容物や表面リガンドなどの
分析をすることでそれらの変化が明らかになる
可能性も考えられます。

//考察//ーー
エクソソームの前駆体である腔内膜小胞の形成は
エンドソーム膜の負の曲率を持つ変形によって
生じるとされています。
微小胞などは細胞膜の正の曲率を持つ変形によって
生じるとされています。
従って、
その曲率を持つ部分に高い結合親和性を持つタンパク質を
細胞外小胞に搭載したいRNAの結合タンパク質として
選択する事によって
そのまま腔内膜小胞、微小胞などの
内腔に引き寄せられて、搭載されるというモデルです。
従って、エクソソームの場合は
負の曲率を持つ部分と結合しやすい
Annexinが関係し、
微小胞の場合は
正に曲率を持つ部分と結合しやすい
MARCKSが関係すると考えられます。

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