RNAキャリアとしての細胞外小胞の詳細

特にエクソソームを含む細胞外小胞の研究では
Killian O’Brien(敬称略)らがTable1に示すように(1)、
miRNAと標的細胞、生理効果について
幅広く研究されています。
しかし、1つ1つの細胞外小胞、多種多様なRNAの生物型
それぞれに着目した研究では
先入観とは異なった見識を得るかもしれません。
Killian O’Brien, Koen Breyne, Stefano Ughetto, Louise C. Laurent & Xandra O. Breakefield
(敬称略)からなる医療研究グループは
上述したことを含めた
RNAキャリアとしての細胞外小胞の詳細について
総括の一部で示されています(1)。
その内容の一部と、追記、考察について
読者の方と情報共有したいと思います。

//RNA分析の困難性//ーー
細胞外小胞は多くの生物型(biotypes)のRNAを示す
多様な配列のRNAを輸送します。
〇RNAの多様性
〇細胞外小胞の小ささ
〇細胞外小胞の異種性
〇細胞外小胞中のRNAの低濃度
これらはサブクラスを持つ細胞外小胞が積載している
RNAの分析、特定、評価を複雑にさせます。
例えば、
microRNAは1～100個の細胞外小胞のうち
1つしか含まれてないほうどの低濃度です(2,3)。
分子量が大きいmRNAでは1000個の細胞外小胞中に
1つしか含まれていないとされています(4)。
1つの細胞から数十時間に放出される細胞外小胞は
数千個から数万個という報告もあります(5)。
それを目安にすると
1つの細胞当たり数十時間で
microRNAは最小で数十個、最大で数万個
mRNAは最小で数個、多くても数十個ということになります。
分析対象を単一細胞に絞って単純化しても
RNAが低濃度、低確率でしか含まれていないことは
時間がかかる(低スループット)の解析となると考えられます。
また、影響しているRNAを特定するためには
異種性があるので統計的に処理していく必要があります。
そのためには非常に多くの細胞外小胞を
分析対象とする必要があります。
サンプルの偏差の大きさが統計的有意性に影響しないか？
という問題が想定されます。

//細胞外小胞に含まれるRNA多様性//ーー
細胞外小胞に含まれるRNAが細胞間のコミュニケーション
においてどのような影響を与えているかを知るためには
RNAの配列とタイプを包括的に分類する必要があります。
実際の測定において以下のRNAタイプがあります。
〇mRNA
〇miRNA
〇ncRNAs(*1)
-
(*1)
small nuclear RNAs, 
small nucleolar RNAS (snoRNAs), 
rRNAs, 
lncRNAs,  
PiWi- interacting RNAs (piRNAs), 
transfer RNAs (tRNAs), 
mitochondrial RNAs, 
Y RNAs 
vault RNAs (vtRNAs)
ノンコードRNAは上記、多種多様です(9-11)。
-
分子量は200～5000 nucletides,あるいはそれ以上です(6-8)。
--
このような多種多様なRNAは大きくは
3つに分類されます。
①転写など機能を持つ。
  ex.mRNAs, miRNAs
②機能を持つが、細胞間の連携を仲介しない。
　ex.piRNAs, vtRNAs
③一部機能があり、残りは無機能の分解物質である。
　ex.tRNA, mRNA, rRNAの破片

//細胞外小胞内外の分析の難しさの例//ーー
身体に有害な遺伝子の翻訳、転写を抑制する
RNA干渉がありますが、
そのためには実際にその抑制の役割を果たす
タンパク質(AGO2など)があります。
これは細胞間のコミュニケーションによる
RNAの働きを調べる上で一つ重要ですが、
細胞外小胞内外でのこれらの機能の切り分けが難しい
とされています。

//搭載RNAの統計的分析//ーー
5つの細胞株で17-35ヌクレオチド配列に絞って
分析した結果(12)。
rRNAの破片：30-94%
Small RNAs(*2):2-40%
(*2)mRNA, piRNAs
このようなRNAタイプの構成、偏りは
条件によって異なります。
例えば、
miRNAが優勢に内包されることもあります(13,14)。
T細胞が活性化している条件では
tRNA破片が多く内包されていました(15)。

//考察//ーー
想定しているよりも細胞外小胞に対するRNA濃度が
低いという事実があります。
定量的に考えていけば、
このRNA濃度は合理性があると考えられます。
細胞外小胞に含まれる多種多様なRNAは
小胞1つ1つに着目すれば、
上で示されたように
不完全な構造であるRNAの破片を
主に含んだものもあるということです。
この事はエクソソームにRNAを含む
薬効ある物質、薬剤を封入した時に
「どれくらいの割合」の細胞外小胞に
「どれくらいの量の」薬剤が含まれるか？
という視点が自然と芽生えます。
しかし、
上述したように細胞内外の周辺の環境によって
どのRNAがどれくらい小胞に入るか？
これは大きく変わるとされています。
その偏差の特徴を理解することも重要です。

(参考文献)
(1)
Killian O’Brien, Koen Breyne, Stefano Ughetto, Louise C. Laurent & Xandra O. Breakefield
RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and its applications
Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 21, pages585–606 (2020)
(2)
Li, M. et al. Analysis of the RNA content of the 
exosomes derived from blood serum and urine and its 
potential as biomarkers. Philos. Trans. R. Soc. B Biol. 
Sci. https://doi.org/10.1098/rstb.2013.0502 (2014).
(3)
Chevillet, J. R. et al. Quantitative and stoichiometric 
analysis of the microRNA content of exosomes.  
Proc. Natl Acad. Sci. USA https://doi.org/10.1073/
pnas.1408301111 (2014).
(4)
Wei, Z. et al. Coding and noncoding landscape of 
extracellular RNA released by human glioma stem 
cells. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-
017-01196- x (2017).  
(5)
Kazuki Hattori, Yuki Goda, Minato Yamashita, Yusuke Yoshioka, Ryosuke Kojima, and Sadao Ota
Droplet array-based platform for parallel optical analysis of dynamic extracellular vesicle secretion from single cells 
bioRxiv  April 10, 2022
https://doi.org/10.1101/2022.04.07.487410
(6)
Valadi, H. et al. Exosome- mediated transfer of mRNAs 
and microRNAs is a novel mechanism of genetic 
exchange between cells. Nat. Cell Biol. https://doi.
org/10.1038/ncb1596 (2007).  
(7)
Skog, J. et al. Glioblastoma microvesicles transport 
RNA and proteins that promote tumour growth and 
provide diagnostic biomarkers. Nat. Cell Biol.  
https://doi.org/10.1038/ncb1800 (2008).  
(8)
Ekström, K. et al. Characterization of mRNA and 
microRNA in human mast cell- derived exosomes and 
their transfer to other mast cells and blood CD34 
progenitor cells. J. Extracell. Vesicles https://doi.org/ 
10.3402/jev.v1i0.18389 (2012).
(9)
Huang, X. et al. Characterization of human plasma- 
derived exosomal RNAs by deep sequencing. BMC 
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319 (2013).
(10)
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Bervoets, S. & Verhaar, M. C. Quantitative and 
qualitative analysis of small RNAs in human 
endothelial cells and exosomes provides insights into 
localized RNA processing, degradation and sorting.  
J. Extracell. Vesicles https://doi.org/10.3402/jev.
v4.26760 (2015).
(11)
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(2015).
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(15)
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doi.org/10.1016/j.celrep.2018.11.073 (2018).