Organ-on-a-chipの殺菌と表面処理と薬剤輸送効率評価モデル

//材料の殺菌//ーー
シリコンなどの吸着性のある物質を含めて
Organ-on-a-chipの意図しない外因性の影響を避けるためには
材料の殺菌処理が必要になります。
これは、循環器系を再現する
マイクロ流体経路でも同じです。
しかし、その殺菌方法は最適である必要があります。
不適切な方法であると、
Organ-on-a-chipやマイクロ経路に
ダメージを与えてしまいます。
それによって意図しないリーク経路などが
生じてしまい、特性に影響を与えてしまいます。
例えば、
共通的なプラスチック
PMMA, PC。
これらなどは従来の加圧滅菌器は
適していないとされています。
なぜなら、熱抵抗が低いからです。
他には紫外線照射、エタノール処理があります。
しかし、紫外線照射は透明性がないため
表面以外の深さのある物質に対する
殺菌には適していません。
また物質が吸収してくれるかもわかりません。
エタノールはPMMAを分解してしまう特性があります。
またPDMSなどにしみこみ、
再度、細胞を作り込んだときに
液体が滲出してしまう恐れがあります。
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ガンマ線の照射や酸化エチレン処理は
臨床の環境においては適している殺菌処理の
選択肢であるとされています。

//材料の表面処理//ーー
Organ-on-a-chipには
プラスチックやシリコンなどの材料と
生体の組織、液体の界面があるので
適性な結果や好ましい組織形成のためには
表面処理をする必要があります。
Pluronic acidは界面活性剤であり、
組織を成長させたときに
凝集して塊ができたり、
分離したりすることを防ぐ効果があります。
これは臓器の機能を維持する上で
重要な項目です(2)。
他には
細胞外マトリックスでコートする事で
基板に対する細胞の吸着力を上げる方法があります。
腸上皮を成長させるときに
これらのコートが使われます(3,4)。
他には血液脳関門の内皮組織です(5-7)。
この時には
組織、疾患特異的な細胞外マトリックスを
使うことができます。
例えば、腸では腺窩様の構造を誘発しました(8,9)。
このバイオマトリックスとして
Matrigel,フィブリン、コラーゲンがあります。
細胞をこれらバイオマトリックスの
液性の前駆体と混ぜるながら
Organ-on-a-chipに搭載する事ができます。
また、バイオマトリックスは
粘着質のある厚みある物質なので
肝臓や皮膚など3次元構造の土台として
利用する事も出来ます。
また、このバイオマトリックスは
特定の細胞種においては維持と分化において
重要な役割を果たすかもしれないとされています。
実際に
Matrigelは神経幹細胞内で
神経細胞の維持、分化を促進しました(10)。
フィブリンベースのゲルは
筋芽細胞の培養の中で筋原性の分化を促進しました(11)。

//細胞種特異的輸送系統(*)の観点//ーー
(*)Cell-type-specific delivey system
細胞種特異的輸送系統において
薬剤輸送効率を分析する事は重要項目の一つです。
それはナノ粒子を使った治療や
分子標的の治療でも同様です。
その評価プラットフォームの一つは
Organ-on-a-chipです。
しかし、当然、等身大の組織を全て
作ることはできませんから、
重要な部分を切り取って評価していくことが
求められると思います。
ナノ粒子や細胞外小胞の輸送バリアとなるのは
①免疫細胞
②血管内皮
③血中デブリ層
④肝臓
⑤腎臓
⑥脾臓
これらが考えられます。
通常生体内ではこれらが密接に相互作用しながら
細胞外小胞やナノ粒子に対して影響を与えます。
しかし、Organ-on-a-chipは
それをよりシンプルにすることが求められますから
それを切り分けて評価する事が
1つの有望な筋、経路であると考えます。
そうした時には
これらの組織、細胞を区分して
段階的に評価する事です。
1つ1つ組織を作って評価していくことも
可能性としてあります。
この方法は技術的な障壁は低いと思います。
もう1つは
①～⑥をつなげて
最終的に⑦の空間で標的細胞を作ります。
脳であれば、間に血液脳関門は必要です。
そのつなげる際に、
できれば流路の大きさを調整して
細胞外小胞のサブタイプを振るいに掛けられる
様にしておくことも考えられます。
しかし、ナノ流体は
界面抵抗があり、その抵抗層で埋められてしまうため
流すために圧力が必要になり、
その圧力でエクソソームが破壊されるなど
影響を受けてしまうかもしれません。
また、ナノレベルの流路を作ることが難しいという
課題もあります。
しかし、Detao Qin(敬称略)ら
医療研究チームは
流路の厚みが100nmで幅が5μm
の流路をマイクロ・フィブリル化によって
作製することに成功されています(12)。
この報告が優れているのは
縦横のアスペクト比が大きい事です。
小さい方をナノオーダーにするだけでも
そのオーダーの粒子を流路でふるいに掛けられる
可能性があるからです。
また長辺方向においてはナノ流体の複雑性を
回避する事もできます。
しかも、透明のシートに流路を光らせることができ
潜在的には蛍光マーカーを付けた
エクソソームの動態を分析することができる
可能性があります(12)。
エクソソームを流路で分析できれば
上述した①～⑥の要素をつなげた状態で
かつそれぞれでの除去損失を別個分析する事が可能です。
あとは、
どのようにOrgan-on-a-chipに組み込むかです。
大きさが小さいという事は
細胞外小胞で特に問題となっている
大きい小胞を除くことができるため
小さなエクソソーム特異的な評価が可能です。

(参考文献)
(1)
Chak Ming Leung, Pim de Haan, Kacey Ronaldson-Bouchard, Ge-Ah Kim, Jihoon Ko, Hoon Suk Rho, Zhu Chen, Pamela Habibovic, Noo Li Jeon, Shuichi Takayama, Michael L. Shuler, Gordana Vunjak-Novakovic, Olivier Frey, Elisabeth Verpoorte & Yi-Chin Toh 
A guide to the organ-on-a-chip
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(2)
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from 2D to 3D cell culture? Front. Mol. Biosci. 7, 33 
(2020).
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Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G. & Ingber, D. E. 
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that experiences intestinal peristalsis- like motions 
and flow. Lab Chip 12, 2165–2174 (2012).  
(4)
Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J. & Ingber, D. E. 
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(5)
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(8)
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(9)
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crypts and colonoids in a microarray platform.  
Lab Chip 13, 4625–4634 (2013).
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cell- derived neural precursor cells. J. Neurosci. Res. 
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(12)
Detao Qin, Andrew H. Gibbons, Masateru M. Ito, Sangamithirai Subramanian Parimalam, Handong Jiang, H. Enis Karahan, Behnam Ghalei, Daisuke Yamaguchi, Ganesh N. Pandian & Easan Sivaniah 
Structural colour enhanced microfluidics
Nature Communications volume 13, Article number: 2281 (2022)