細胞外小胞の生成とRNAの取り込み

エクソソームを含む細胞外小胞による
生物学、生理学、病態生理学はどのようであるか？
また、それらをどのように
検査、診断、治療に生かすことができるか？
その精度を高めていくためには
細胞外小胞の細胞内での生成過程や
内容物の内包過程について
基礎的な事も含めて、
詳しく研究、調査する必要があります。
--
Killian O’Brien, Koen Breyne(敬称略)らからなる
医療研究グループは上述した
細胞外小胞の生成や内包過程(RNA)についての
基礎的な内容を総括されています(1)。
本日はその内容の一部、追記、考察を
読者の方と情報共有したいと思います。

細胞外小胞の生成は詳しく研究され
いくつかのモードが存在し、
生成過程を駆動するいくつかの分子成分があります(2,3)。
(参考文献(1) Fig.2参照)
エクソソーム、オンコサム、
アポトーシス小体、レトロウィルス様小胞。
これらの細胞外小胞のサブカテゴリは
どのように生成されるか？
さらに
細胞外小胞内にRNAがどのように内包されるか？
それらについてそれぞれ下記します。

//エクソソーム//ーー
エクソソームはエンドソームの膜への陥入によって生じます。
それによって内腔にいくつかの腔内膜小胞が生じた
エンドソームは後期課程で多胞体と呼ばれます。
このプロセスには下記、いくつかの物質が関わります。
〇RAB27A/RAB27B,
〇tumour susceptibility gene 101 protein
(TSG101)
〇ALIX
〇Vacuolar protein sorting-associated protein 4
(VPS4)(2)
〇lipid microdomains(lipid rafts)(4)
-
腔内膜小胞を形成後、多胞体は細胞膜と融合し
細胞外にエクソソームとして放出されます。
(*)実際にエクソソームという名称となるのは
細胞外に放出したあとです。
-
エクソソームの放出は細胞骨格の運動性に依存します。
エクソソームの前駆体である腔内膜小胞を
含む多胞体の移動は微小管を通じて生じます(5)。
そこでは
〇分岐したアクチン
〇Arp2/3による重合化
これらが起こります。
〇アクチン結合タンパク質(cortactin)
これによって安定化されます。
これらが細胞膜との融合過程を補助します(6)。

//オンコサム//ーー
オンコサムは癌細胞の細胞膜を膨らませることによって
外部に放出されます
このオンコサムは通常、微小胞よりも大きいとされています。
この生成は癌細胞の運動性と関連しています(7-10)。
この生成は
〇アクチン束化タンパク質 fascin
〇アクチン細胞膜クロスリンカー ezrin
〇細胞表面糖たんぱく質 podocalyxin
これらが関わっています。
細胞膜の突出と切断に関わっているとされます。
⇒
従って、オンコサムの生成過程に関わるアクチンなどの
活動を抑える事で癌の治療に応用できる可能性があります。

//アポトーシス小体//ーー
オンコサムと同様に大きな小胞です。
アポトーシスの際に細胞膜のブレブ形成(水泡)、
スパイク様の突出状態が破れ、形成されます(2,10)

//レトロウィルス様小胞//ーー
レトロウィルス様のGagタンパク質のような
ウィルスを起源とするタンパク質が駆動して
細胞膜が突出して、
ウィルス様の細胞外小胞が放出されることもあります。
(参考文献(1) Fig.2参照)

//RNAの細胞内移動、複合体//ーー
〇小さなサイズ
〇量が多い
〇膜との相互作用が強い
〇細胞質に多く分布
これらの特徴があるRNAが細胞外小胞に取り込まれやすい
とされています。
細胞内でのRNAの輸送(細胞核から)はタンパク質と複合体
を作る事によって起こることが多いとされています。
このタンパク質の複合体は
RNA結合タンパク質(RBPs)と呼ばれます。
これらが融合し、リボ核タンパク質粒子を作ることで
細胞骨格を通して移動することができます(11,12)。
哺乳類細胞には500個以上のRNA結合タンパク質がある
といわれています(13)。
細胞外小胞に含まれるたんぱく質の約25%は
このRNA結合タンパク質であると言われています(32)。

//細胞外小胞内RNA取り込み//ーー
細胞外小胞内RNA取り込みは
〇Specific RNA sequence motifs(14,33)
〇Secondary configuration(14,33)
〇膜への親和性(15-17)
〇AGO2(34)
〇ALIX(35)
〇Annexin A2(18,19)
〇Major vault protein(MVP)(20,21)
〇HuR(22)
〇Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1
(HNRNPA2B1)(23)
〇YBX1(24-26)
〇SYNCRIP(27,28)
〇Lupus La protein(29)
〇Arc1(30)
-
細胞外小胞の内包物を仕分けする信号は
RNA、RNA結合タンパク質を装飾改変します。
〇ubiquitylation
〇sumoylation
〇phosphorylation
〇uridylation
これらはRNAの
●スプライシング
●安定性
●翻訳
●miRNA生成
これらに関わります(31)。
-
上述したように多くの機序がRNAの内包に
影響を与えますが、
どのようにそれを制御しているかの詳細は
まだはっきりとはわかっていません(1)。

//考察//ーー
エクソソームの形成過程に関わる物質がいくつかあるので
その活性を制御する事によって、
エクソソームの生成を促進、あるいは抑制する事ができる
可能性があります。
エクソソームは疾患にも関わるので、
エクソソームの放出を制御することによる
治療も考えられるからです。
それは同様に癌細胞から放出される
オンコサムでも当てはまります。
また、エクトサムやアポトーシス小体は
直接的に細胞膜を突き出して放出されますが、
その駆動力となる物質を突き止め、
それがエクソソームの生成駆動物質と異なる物質で有れば、
それを特異的に抑えることで
エクソソームだけを分泌させることができる可能性もあります。
細胞外小胞のサブカテゴリを分類するのは
難しいとされています。
例えば、
エクソソームだけを薬剤輸送媒体として使いたい場合に、
他の小胞生成過程を抑える事で
精製のレベルを上げられる可能性があります。

(参考文献)
(1)
Killian O’Brien, Koen Breyne, Stefano Ughetto, Louise C. Laurent & Xandra O. Breakefield
RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and its applications
Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 21, pages585–606 (2020)
(2)
Mathieu, M., Martin- Jaular, L., Lavieu, G. & Théry, C. 
Specificities of secretion and uptake of exosomes  
and other extracellular vesicles for cell-to-cell 
communication. Nat. Cell Biol. https://doi.org/ 
10.1038/s41556-018-0250-9 (2019).
(3)
Van Niel, G., D’Angelo, G. & Raposo, G. Shedding light 
on the cell biology of extracellular vesicles. Nat. Rev. 
Mol. Cell Biol. https://doi.org/10.1038/nrm.2017.125 
(2018).
(4)
Pollet, H., Conrard, L., Cloos, A. S. & Tyteca, D. 
Plasma membrane lipid domains as platforms for 
vesicle biogenesis and shedding? Biomolecules 
https://doi.org/10.3390/biom8030094 (2018).
(5)
Mittelbrunn, M., Vicente- Manzanares, M. &  
Sánchez- Madrid, F. Organizing polarized delivery of 
exosomes at synapses. Traffic https://doi.org/10.1111/
tra.12258 (2015).
(6)
Sinha, S. et al. Cortactin promotes exosome secretion 
by controlling branched actin dynamics. J. Cell Biol. 
https://doi.org/10.1083/jcb.201601025 (2016).
(7)
Hoshino, D. et al. Exosome secretion is enhanced by 
invadopodia and drives invasive behavior. Cell Rep. 
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2013.10.050 (2013).
(8)
Minciacchi, V. R., Freeman, M. R. & Di Vizio, D. 
Extracellular vesicles in cancer: exosomes, 
microvesicles and the emerging role of large 
oncosomes. Semin. Cell Dev. Biol. https://doi.
org/10.1016/j.semcdb.2015.02.010 (2015).
(9)
Meehan, B., Rak, J. & Di Vizio, D. Oncosomes - large 
and small: what are they, where they came from?  
J. Extracell. Vesicles https://doi.org/10.3402/ 
jev.v5.33109 (2016).
(10)
Caruso, S. & Poon, I. K. H. Apoptotic cell- derived 
extracellular vesicles: more than just debris.  
Front. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu. 
2018.01486 (2018).
(11)
Di Liegro, C. M., Schiera, G. & Di Liegro, I. Regulation 
of mRNA transport, localizationand translation in the 
nervous system of mammals (review). Int. J. Mol. Med. 
https://doi.org/10.3892/ijmm.2014.1629 (2014).
(12)
Eliscovich, C., Buxbaum, A. R., Katz, Z. B. & Singer, R. H. 
mRNA on the move: the road to its biological destiny. 
J. Biol. Chem. https://doi.org/10.1074/jbc.
R113.452094 (2013).
(13)
Gerstberger, S., Hafner, M., Ascano, M. & Tuschl, T. 
Evolutionary conservation and expression of human 
RNA- binding proteins and their role in human genetic 
disease. Adv. Exp. Med. Biol. https://doi.org/10.1007/ 
978-1-4939-1221-6_1 (2014).
(14)
Mateescu, B. et al. Obstacles and opportunities in  
the functional analysis of extracellular vesicle  
RNA - an ISEV position paper. J. Extracell. Vesicles 
https://doi.org/10.1080/20013078.2017.1286095 
(2017).
(15)
Kosaka, N. et al. Secretory mechanisms and 
intercellular transfer of microRNAs in living cells.  
J. Biol. Chem. https://doi.org/10.1074/jbc.M110.107821 
(2010).
(16)
Khvorova, A., Kwak, Y. G., Tamkun, M., Majerfeld, I. & 
Yarus, M. RNAs that bind and change the permeability 
of phospholipid membranes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 
https://doi.org/10.1073/pnas.96.19.10649 (1999).
(17)
Janas, T., Janas, M. M., Sapo ń , K. & Janas, T. 
Mechanisms of RNA loading into exosomes. FEBS 
Lett. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2015.04.036 
(2015).
(18)
Hagiwara, K., Katsuda, T., Gailhouste, L., Kosaka, N. & 
Ochiya, T. Commitment of annexin A2 in recruitment 
of microRNAs into extracellular vesicles. FEBS Lett. 
https://doi.org/10.1016/j.febslet.2015.11.036 
(2015).
(19)
Otake, K., Kamiguchi, H. & Hirozane, Y. Identification 
of biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis by 
comprehensive analysis of exosomal mRNAs in human 
cerebrospinal fluid. BMC Med. Genomics https://doi.
org/10.1186/s12920-019-0473- z (2019).
(20)
Teng, Y. et al. MVP- mediated exosomal sorting of  
miR-193a promotes colon cancer progression.  
Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/ncomms14448 
(2017).
(21)
Statello, L. et al. Identification of RNA- binding proteins 
in exosomes capable of interacting with different types 
of RNA: RBP- facilitated transport of RNAs into 
exosomes. PLoS One https://doi.org/10.1371/journal.
pone.0195969 (2018).
(22)
Mukherjee, K. et al. Reversible HuR‐micro RNA 
binding controls extracellular export of miR‐122 and 
augments stress response. EMBO Rep. https://doi.org/ 
10.15252/embr.201541930 (2016).
(23)
Villarroya- Beltri, C. et al. Sumoylated hnRNPA2B1 
controls the sorting of miRNAs into exosomes through 
binding to specific motifs. Nat. Commun. https://doi.org/ 
10.1038/ncomms3980 (2013).
(24)
Shurtleff, M. J., Temoche- Diaz, M. M., Karfilis, K. V., 
Ri, S. & Schekman, R. Y- box protein 1 is required to 
sort microRNAs into exosomes in cells and in a cell- 
free reaction. Elife https://doi.org/10.7554/
eLife.19276 (2016).
(25)
Yanshina, D. D. et al. Structural features of the 
interaction of the 3′- untranslated region of mRNA 
containing exosomal RNA- specific motifs with YB-1,  
a potential mediator of mRNA sorting. Biochimie 
https://doi.org/10.1016/j.biochi.2017.11.007 (2018).
(26)
Kossinova, O. A. et al. Cytosolic YB-1 and NSUN2 are 
the only proteins recognizing specific motifs present in 
mRNAs enriched in exosomes. Biochim. Biophys. Acta 
https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2017.03.010 
(2017).
(27)
Santangelo, L. et al. The RNA- binding protein 
SYNCRIP is a component of the hepatocyte exosomal 
machinery controlling microRNA sorting. Cell Rep. 
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.09.031 (2016).
(28)
Hobor, F. et al. A cryptic RNA- binding domain 
mediates Syncrip recognition and exosomal 
partitioning of miRNA targets. Nat. Commun. https://
doi.org/10.1038/s41467-018-03182-3 (2018).
(29)
Temoche- Diaz, M. M. et al. Distinct mechanisms of 
microRNA sorting into cancer cell- derived extracellular 
vesicle subtypes. Elife https://doi.org/10.7554/
eLife.47544 (2019).
(30)
Ashley, J. et al. Retrovirus- like Gag protein Arc1 binds 
RNA and traffics across synaptic boutons. Cell https://
doi.org/10.1016/j.cell.2017.12.022 (2018).  
(31)
Liu, X. et al. A microRNA precursor surveillance 
system in quality control of microRNA synthesis.  
Mol. Cell https://doi.org/10.1016/j.molcel.2014.07.017 
(2014).
(32)
Sork, H. et al. Heterogeneity and interplay of the 
extracellular vesicle small RNA transcriptome and 
proteome. Sci. Rep. https://doi.org/10.1038/s41598-
018-28485-9 (2018).
(33)
 Ragusa, M. et al. Asymmetric RNA distribution among 
cells and their secreted exosomes: biomedical meaning 
and considerations on diagnostic applications. Front. 
Mol. Biosci. https://doi.org/10.3389/fmolb.2017.00066 
(2017).
(34)
McKenzie, A. J. et al. KRAS- MEK signaling controls 
Ago2 sorting into exosomes. Cell Rep. https://doi.
org/10.1016/j.celrep.2016.03.085 (2016).
(35)
Iavello, A. et al. Role of Alix in miRNA packaging 
during extracellular vesicle biogenesis. Int. J. Mol. 
Med. https://doi.org/10.3892/ijmm.2016.2488 
(2016).