//結果分析//ーー
Organ-on-a-chipは複雑で、多くの労力を必要とします。
最大で28日程度の長い実験時間が必要です。
Organ-on-a-chipから最大限の情報を得るためには
オフラインとその場観察(in situ)の両方の分析が必要です。
結果を評価するときには
〇生理学、測定のタイムスケールの関係
〇システム、臓器レベルの空間分解能
〇測定が定量的か、定性的か
これらを考慮する必要があります。
生物学的な反応と測定を合わせる事は重要です。
例えば、
心臓の伝導速度は数秒単位です。
一方、細胞の運動性は数時間かかります。
神経ネットワークではミリ秒以下です。
多臓器システムでは
様々な臓器特異的、かつ局所的な出力を
同時にモニターすることは全体を理解する事につながります。
例えば、薬剤の働きを評価するときには
標的臓器の効果と他の臓器の副作用の評価を
同時に行うことができます。
//オフライン、その場分析//ーー
Organ-on-a-chipの恒常性、反応を分析するために
複数の分子の間欠的な測定は望ましいです。
オフライン、高機能の
〇liquid chromatography/mass spectrometry (HPLC/MS)
〇multiplexed(bead-based)protein-binding/DNA-binding assays
これらは実用的な技術です。
同時に広範囲の異なる化学物質を測定する事ができます。
そのうちの多くはバイオマーカーとなります。
両方のオフラインの分析方法は
マイクロリットルの量で行うことができます。
これはワンパスの灌流で使われる流量と互換性を持ちます。
様々な商用のアッセイキットは
バイオマーカーの代替として使う事ができます。
例えば、肝臓のシステムに対して
〇albumin
〇lactate dehydrogenase
〇alanine amino transferase
〇aspartate aminotransferase
〇urea
これらです。
但し、血清などの媒体との相互作用は
注意深く考慮する必要があります。
浮遊物のオンライン、その場の測定は
最小の時間遅れで栄養物や代謝生成物を測定する事ができます。
小型のセンサーは
optical detection exploiting dyesに基づいて
使う事が出来ます(2)。
溶解酸素は代謝生成物の中で鍵となる因子で
特に肝臓のCYP450活性に関してはそうです(3-5)。
溶解酸素とpHは両方
マイクロプローブとpH-sensitiveパッチ
で調べることができます(6)。
光学検出は顕微鏡とファイバーを必要とします。
時間と労力を減らす自動技術が提案されています(7,8)。
グルコースや乳酸塩は
電気化学酵素ベースバイオセンサーによって
測定する事ができます(9,10)。
//機能評価//ーー
バイオマーカーは
〇薬剤、化粧品、食糧に対する身体の反応
〇化学物質への暴露
これらに関する重要な生物学的結果を与えます。
これは機能的な組織反応です。
理想的には
機能評価は非破壊で、その場観察が必要です。
特に長期間にわたり再循環が必要なシステムでは
求められます。
機能評価は反応に対して数秒以内の急速な情報を
提供しなければなりません。
//エンドポイント分析//ーー
Organ-on-a-chip内の細胞、遺伝子、タンパク質に対して
オンラインで有用なデータを得る事は難しいので
〇組織分析
〇溶解アッセイ
〇トランスクリプトーム
〇細胞運動アッセイ
などのエンドポイント分析をするために
装置を分解する必要があるかもしれません(11,12)。
そのために分解しても
細胞、組織、表面状態がダメージを受けないような
設計にする必要があります。
免疫細胞、癌細胞のように循環する細胞は
液体媒質からサンプリングします(13)。
しかしながら、
多くのマイクロ流体デバイスでは
実験の間に循環細胞が壊れてしまいます。
流体ダイナミクスはデバイスをデザインする間に
考慮される必要があります。
損傷なく細胞を抜き取る技術は難しく
それをするためには専門性が必要です。
//顕微鏡//ーー
顕微鏡は細胞生物学では
分析のために共通的に使われる方法です。
ほとんどのOrgan-on-a-chipは
ガラス、PDMS、サーモプラスチック。
これらのように透明であり、
イメージ深さよりも薄く形成されています。
従って、顕微鏡による分析が可能です。
細胞は蛍光染色、抗体などによって
光学的に可視化できるようにします(14)。
--
〇共焦点顕微鏡法
〇light-sheet顕微鏡法
〇イメージサンプル準備手順
(クリアリング、染色など)
これらを含む顕微鏡技術は顕著に向上しています。
また複雑で、3次元の対象物も扱うことができます。
高含量イメージングは
細胞と組織の表面状態の時空間情報を提供します。
これは病態生理学を明らかにし
新たな治療を評価する上で助けとなります。
Organ-on-a-chipは顕微鏡の空間分解能を
守るためにマイクロステージに設置できるように
しておく必要があります。
上述したイメージサンプルの準備手順他に
イメージを分析するツールも必要です(15)。
画像分析は機械学習アルゴリズムが
有効なツールとされています。
例えば、
deep learning convolutional neural networks
これを使って、癌組織の回転楕円体を
非侵襲で画像化する事が可能です(16)。
//経上皮電気抵抗//ーー
経上皮電気抵抗は
〇胃腸
〇腎臓
〇血液脳関門
これらなどのバリアの健全性と浸透性を評価する
ための共通的な方法です。
血液脳関門でタイトで健全な組織では
おおおそ1500～1800Ω/cm^2(17)。
一方、
腎臓の近位尿細管では70Ω/cm^2(18)。
これらです。
Organ-on-a-chipの組織、臓器では
生理学的に正しい値を示さなければなりません。
--
経上皮電気抵抗は
オーム法則手法、インピーダンス分光法
これらがあります。
マイクロ電極がつけられるか？
組織に埋め込まれるか？
どちらかです(19-22)。
インピーダンス分光法はフィッチングアルゴリズムがあり
オーム法則手法よりも正確ですが、
オーム法則手法は手順が単純です。
インピーダンス分光法は組織の大きさと健全性を
測ることができます(23)。
電極は正確に設置する必要があります。
また組織全体に電流が均一に流れる必要があります。
//微小電極アレイとカンチレバー//ーー
微小電極アレイは細胞や組織の電気的活性を測る方法です。
カンチレバーは機械的な力を測る方法です(24,25)。
例えば、
微小電極アレイは伝導速度、ビート頻度、
電場電位時間(QTインターバル)
これらを測ることができます(26)。
これは
〇心臓
〇神経筋接合部
〇骨格筋収縮
〇神経システム
これらに適用できます(27-30)。
例えば、神経のプレ-ポストシナプス信号を
測ることができます(31)。
細胞や組織の収縮の力はカンチレバーのたわみに
よって測ることができます。
測定したい検体をパターン化して
カンチレバーのたわみを光学的、電気的に分析する
ことによってその力を定量化します(32,33)。
前述した経上皮電気抵抗と微小電極アレイ。
これらを組み合わせることもできます。
例えば、心臓で試されています(34)。
//まとめ//ーー
Organ-on-a-chipの培養条件、バイオマーカー
臓器の機能のリアルタイムのその場観察は
Organ-on-a-chipを改善するだけではなく
それで可能な実験の幅も広がります。
//考察//ーー
分析の精度を上げるためには
光学的、電気的、機械的にそれぞれ分析できるように
Organ-on-a-chipをデザインする事が
1つの考え方であると理解しています。
また、そもそも形成した組織が
生体内の実情と合っているかどうかも
分析の精度が上がれば、そのチェックができると考えます。
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初期ステージで癌を検出するために
臨床医は様々な医療情報を総合して判断します。
〇既往歴
〇画像診断データ
〇テスト結果
〇外科的な所見
これらなどです。
癌の早期発見は患者さんの
身体への負担を軽減し、
生存率を向上させることができます。
そのための理想的な診断方法は
正確に、かつ非侵襲で癌を検出する事です。
その点において液体生検の期待は大きいです。
すでに
〇carcinoembryonic antigen (CEA)
for adenocarcinoma
〇squamous cell carcinoma antigen
for various squamous cell carcinomas
〇protein induced by the absence of vitamin K antagonist-II
for hepatocellular carcinoma (HCC)
〇alpha-fetoprotein
for yolk sac tumors and HCC
〇cancer antigen 125
for ovarian cancer
〇prostate-speci fi c antigen (PSA)
for prostate cancer (PCa)
これらがそれぞれの癌に対する抗原として知られています。
しかし、マーカーとしての特異性は低く
偽陽性や偽陰性などの問題が生じます(2-6)。
一方、
新しい診断方法として
近年、細胞外小胞が注目されています(7-11)。
細胞外小胞は様々な体液に含まれています。
細胞外小胞は
〇表面リガンドを含むタンパク質
〇RNA(mRNA, long/short noncoding RNA)
これらなどを含みます。
これらは脂質2重層で被覆されています。
--
Nobuyoshi Kosaka(敬称略)ら
医療研究グループは
バイオマーカーとして細胞外小胞の
現状の研究について総括されています(1)。
その内容のうち、細胞外小胞のマーカーのうち
タンパク質の部分を参照し、
その内容の一部、追記を読者の方と
情報共有したいと思います。
細胞外小胞の内容物は
それを分泌した親細胞の影響を受けます。
従って、癌細胞においても同様です。
疾患特異的な物質を含みます。
細胞外小胞におけるタンパク質の分析では
主に表面リガンドの分析に依ります。
例えば、
転移性メラノーマでは
PD-L1を細胞外小胞表面に発現し
CD8 T細胞の機能や腫瘍成長を抑制します(12)。
癌由来の細胞外小胞では
特徴的なインテグリンを表現しています。
特異的なインテグリンは転移サイトに関連し、
どこに転移するか予測することができます(13)。
細胞外小胞上のカベオリン1は
癌の状態を反映します。
またそれは
ELISAベースの方法であるExoTESTを発展させました。
メラノーマではこのExoTESTによって
CD63とカベオリン1を健康な人よりも
多く発現していることがわかりました。
その感受性は43～68%です。
デルタカテニン、カベリオン1、CD59は
前立腺癌の細胞外小胞の尿分析によって検出されました。
転移性の前立腺癌の細胞外小胞の尿分析によって
α1インテグリン、β1インテグリンが
転移性ではない患者さんに対して
増えていることがわかっています(14)。
ExoScreenアッセイによって
循環している細胞外小胞の分析を
初期ステージの大腸癌の診断のために利用できます(15)。
この分析は抗体を使った蛍光発光分析によって
行われています。
分析対象の表面リガンドはCD9, CD147です。
CD9は細胞外小胞のマーカータンパク質です。
CD147は大腸癌細胞株で多く発現されています。
ステージ1の大腸癌患者さんでは
CD9/CD147両方の陽性の細胞外小胞が検出されました。
また、CD147は外科手術によって
癌細胞を取り除いた後、低下したことがわかりました。
従って、癌細胞と関連があると考えられます。
表面プラズモン共鳴を使った
エクソソーム検出法であるnPLEXによって
卵巣癌細胞株でEpCAM, CD24をマーカーとして
検出しました。
//考察//ーー
細胞外小胞による診断は
細胞外小胞表面にあるリガンド(タンパク質)を
高精度、高スループットで分析できる方法が見つかると
一気にその可能性が広がると考えられます。
潜在的には親細胞種の特定もできると考えられます。
血中に分散、混在している
様々な親細胞由来の細胞外小胞がありますが、
そこから必要な細胞外小胞を抽出できます。
その中にはタンパク質やRNAなどの物質も含まれるので
多面的に病変細胞の状態を分析することができる
可能性があります。
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Organ-on-a-chipは薬剤研究のために使われます。
その吸収、分布、代謝、排出、毒性などを評価します。
その装置、システムの機能性は
デザインの中で一番優先されるものです。
初めの決定事項はOrgan-on-a-chipを
単一臓器か多臓器システムどちらかにするかです。
単一臓器システムの場合は
その臓器、組織特異的な機能を研究できます。
多臓器システムでは臓器間の相互作用を調べる
ことができます。
Chak Ming Leung, Pim de Haan(敬称略)ら
医療研究グループは
単一臓器か多臓器システムそれぞれにおいて
デザイン、材料選択、製造、生存のサポートなどについて
ケーススタディーとして総括されています(1)。
その内容の一部、追記、考察を読者の方と
情報共有したいと思います。
//単一臓器システム//ーー
経口投与の薬剤の腸での吸収は
共通的にTranswell assaysで調べられます。
その構造が参考文献(1)Fig.3Aaに示されています。
薬剤が通過する層の間に腸の上皮組織が層として
形成されます。その通過を見る事で
薬剤の吸収を評価します。
またFig.3Abに示されるように
その吸収プロセスをマイクロ流体に組み込む
こともできます(2)。
この上皮組織は細孔のある被膜の上に成長されます。
筺体を含む材料としてはPDMSが使われます。
透明で、生体互換性のあるシリコンラバーで
フォトリソグラフィーなどで作ることができます。
被膜はコラーゲン表面コードで前処理され
細胞の吸着が向上するようにします。
Caco-2細胞は薬剤の吸収を評価する研究としては
王道となる細胞株です。
マイクロチャネルの中で培養されます。
これらの細胞は腸上皮細胞が持っている
多くの他の機能を失わせますが、
一般的な薬剤吸収の研究としては適しています。
腸のOrgan-on-a-chipは培養液の中に留められ
その培養液は再循環しない2つのシリンジポンプによって
供給される細胞媒質と共に存在しています。
これらのデバイスは
液体クロマトグラフィーや蛍光ベースアッセイによって
工学的に薬剤の吸収について調べます。
--
新型コロナウィルスの単一臓器の
Organ-on-a-chipについてもデザインされています。
抗ウィルス薬のテストの為です(3)。
ウィルス感染のプロセスは複雑で
免疫機能や他の臓器の関与もあります。
しかし、ここでは
腸の上皮、血管壁、免疫機能について
2つのチャネルを持つOrgan-on-a-chipが設計されています。
筺体を含む材料は弾性のあるシリコンラバーで
浸透性膜はコラーゲン、Matrigelで前処理されました。
被膜の弾性は組織の蠕動様の運動を作動させるために
利用されています。
腸のオルガノイドは患者さんの生検サンプルから
取り出し、培養しました。
内皮細胞はもう一つの側面に形成され、
腸の血管機能を含めています。
末梢の血液単球細胞は患者さんの血液から分離されています。
蛍光発光を認識する光学的な分析の他に
オフラインの遺伝子分析も
腸のウィルス感染を分析するのに使われています。
//多臓器システム//ーー
チップ上の多臓器システムは
生体内の全体の分布を模倣する事を前提に設計されます。
また、ナフタレンに対する毒性についても調べられます(4)。
例えば、
肺、肝臓、脂肪組織、他の組織の4つに区分けされた
多臓器システムを形成した場合には
循環の順番と滞留時間が実態と合うように検討されます。
初めに肺に液体を流した後、
その液体を以下の比率で分散させます。
脂肪組織:9%、肝臓:25%、他の組織:66%。
このようにです。
また上述したようにナフタレン毒性についても
調べられました。
これらの区分けされた多臓器システムは
ナフタレンの分布、代謝を可能にするため
重要な相互接続が完備されています。
筺体を含む材料としてetchedシリコンと
machined PMMAを組み合わせて使います。
これらの材料は光学的な評価が可能です。
このケーススタディーでは
肺と肝臓の組織はラットの細胞が含んでいました。
循環器系の動力は蠕動が使われています。
小型化されたラットベースのシステムから
人の組織の状態を外挿して評価する事は
以前、難しいとされています。
近年、肺や肝臓といった組織も
単純な細胞株で人由来の物を作ることが可能になっています。
従って、上述した互換性の問題も
一部は解消される可能性があります。
--
薬剤発見のための生理的に関連性のある
多臓器Organ-on-a-chipシステムの開発を狙いとして
薬剤の代謝についても発展しています(5)。
このシステムでは
7～10の臓器モデルを統合的な流体回路に組み込み
それぞれの相互作用を調べます。
このデバイスは
ポリスルホン、ポリウレタンの簡単なプロセスで
製造されます。空気圧制御バルブで
メディアを循環させます。
腎臓、筋肉、肝臓、腸などは
iPS細胞技術を使って人の細胞から作られています。
薬剤(ジクロフェナク)を腸に届け、
そこから他の臓器に循環させます。
実際に生体内はより複雑ですが、
その複雑性を模倣しようとすると
コストやフットプリントを高く、大きくする
必要があります。
従って、適切な妥協点があると考えられます。
--
多臓器システムは抗がん剤の効果、毒性の評価
にも使われます(6)。
固形癌や血液性の癌などが対象です。
筺体を含む材料はPDMS、ガラス、プラスチック
これらが使われ、簡易的なプロセスで作製されます。
癌は様々な悪性条件で
Organ-on-a-chip内で培養されます。
これらのデバイスはポンプレスで扱いやすくなっています。
重力によって循環するシステムです。
従って、フットプリントを下げる事ができます。
--
単一臓器システムは大きくは2つの過程があります。
準備と実験です。
細胞培養、組織化のためには時間が必要です。
成熟したら実験のフェーズに入ります。
--
多臓器システムは2つの動作過程があります。
まずは分けて成熟を促し、
適当なタイミングでそれらをつなぎ合わせます。
//考察//ーー
臓器の数に関わらず、Organ-on-a-chipでは
見たい特性をできるだけ再現しながら
如何にシステムをシンプルにできるか？
という所が一つの鍵であると考えられます。
生体内で影響の小さいと考えられる
交絡因子は取り除いて、
本当に必要な因子だけを反映した形で
評価していくことです。
その中で、
Transwell assaysのように
組織とその機能を1つに絞り込むというのも
選択肢として適切であると考えます。
(参考文献)
(1)
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細胞種特異的輸送系統
(Cell-type-specific delivery system)においては
病変部位の細胞が特異的に発現している
表面リガンドを見つけ、
それに結合親和性の高い表面リガンドを
ナノ粒子、細胞外小胞に装飾することを目的としています。
それによって病変部位への輸送効率を高めます。
その際にそのたんぱく質を探索する必要があります。
そのやり方によっては
リスクが大きくなるかもしれないという懸念があります。
それに対する現時点で持っている一つの答えは
免疫細胞由来の細胞外小胞(エクソソームなど)を使う事です。
Clotilde Théry, Laurence Zitvogel & Sebastian Amigorena
(敬称略)がリソースとして示しているように
免疫細胞由来のエクソソームは
免疫細胞が持つ機能の一部を引き継いでいます。
元々、免疫細胞は非自己抗原など異物を発見したら
免疫機能が高まり、病変部位に対して反応する機序を持っています
この時に病変部位に対して
免疫機能が一定の向性、走化性を有していれば、
機能化したエクソソームを使うことで
他の機能を病変部位に有効に作動させることができます。
細胞ではなく、エクソソームを使う事の利点は
エクソソームは核酸や薬剤などを封入できるからです。
細胞では消化されてしまうため
CAR-T細胞のように細胞外の受容体に機能を持たせる
ことに留める必要があります。
ここで重要になるのが、前述したように
病変部位で機能が高まった免疫細胞の分布、過程です。
その走化性、向性の機序を理解する事が
エクソソームをどの細胞由来で得るかの選択に影響を与えます。
例えば、下のResourceに示しているように
インテグリンに結合するICAM1は
B細胞や樹状細胞由来のエクソソームに発現されています。
転移性の癌では特異的なインテグリンが発現されている
ことが確かめられていますから、
それに対するICAM1依存的な走化性はどうか？
このような視点があります。
あるいはるMHCクラスⅠ、Ⅱは
抗原提示によって免疫細胞を引き付けます。
癌細胞などで発現されています。
その際にキラー、ヘルパーT細胞が引き付けられますが、
同じ機序でエクソソームも引き付けられるかもしれません。
そこで一定の向性、走化性が生まれる可能性もあります。
癌抗原が多く分布している周辺の場所では
癌細胞そのものだけではなく、
エクソソーム、免疫細胞依存的にも
MHCクラスⅠ、Ⅱ依存的に引き付けられます。
なぜならMHCクラスⅠ、Ⅱは免疫細胞由来の
エクソソームにも分布しているからです。
そうすると病変部位付近の多く抗原があるところに
エクソソームも同様に多く分布します。
これは抗原提示したMHCクラスⅠ、Ⅱが
免疫細胞由来のエクソソームを引き付けること
を前提にしているので
これが成り立つかどうかが非常に重要です。
このような病変部位のエクソソームの局在化は
循環器を通しての免疫細胞由来のエクソソームの
輸送媒体としての潜在性を与えます。
--
また免疫細胞由来のエクソソームは
ナノ粒子でも同様に懸念される
移植片対宿主病(拒絶反応)、免疫惹起を
潜在的に抑える事ができる可能性もあります。
なぜなら、免疫細胞そのものから生まれた
小胞だからです。
自家移植の場合は当然そうですが、
異なるドナーでもNK細胞、樹状細胞など
自然免疫系由来のエクソソームでは
そのような拒絶反応は生じにくいかもしれません。
--
加えて、
すでにわかっている病変部位、
免疫細胞由来のエクソソームそれぞれの
表面リガンドの中の組み合わせの中で
高い親和性を示すものを見つけるという
帰納的なプロセスも役立ちます。
その遺伝子を明らかにし、抽出することで
標的性が上がるように過剰発現させる方法も考えられます。
その方法では想定されるリスクは
新規のタンパク質を探索するよりも
顕著に小さくなります。
--
Clotilde Théry, Laurence Zitvogel & Sebastian Amigorena(敬称略)
からなる医療研究グループは
2002年の時点でわかっている
主に免疫細胞由来のエクソソームが発現している
タンパク質についてのリソースを提供されています(1)。
そのリソースを引用させていただき、
付加的な説明を加え、
読者の方と情報共有したいと思います。
//Resource//ーー
(参考文献(1) Table1参照)
(*)各細胞種(〇)由来の
エクソソームタンパク質
-----
<抗原提示>
(*)MHCクラスⅠ
〇B細胞(2)
〇樹状細胞(3)
〇腸細胞(4)
〇癌細胞(5)
〇T細胞(6)
MHCクラスI分子の機能は細胞内のタンパク質に由来する
ペプチド断片を細胞傷害性T細胞へ提示することであり
これが非自己抗原であれば、免疫応答が開始されます。
上述した細胞由来のエクソソームを通じて
非自己抗原があった時にキラーT細胞の活性を促す
ことができます。
-
*MHCクラスⅡ
〇B細胞(7)
〇樹状細胞(3)
〇腸細胞-IFN-γ処置(4)
〇マスト細胞(8)
〇T細胞(6)
これはMHCクラスI分子と同様に抗原提示しますが、
ヘルパーT細胞に対して行います。
-----
<インテグリン>
細胞表面の原形質膜にあるタンパク質で、細胞接着分子です。
α鎖、β鎖のヘテロダイマーで人では24種類が見つかっています。
(*)α4β1
〇網赤血球(9)
-
(*)αMβ2
〇樹状細胞(10)
-
(*)β2
〇T細胞(6)
-
(*)αLβ2
〇マスト細胞(11)
-----
<免疫グロブリンファミリーメンバー>
(*)ICAM1/CD54
〇B細胞(12)
〇樹状細胞(13)
〇マスト細胞(11)
ICAM-1は細胞表面の糖タンパク質であり、
一般的には血管内皮細胞と免疫系の細胞で発現しています。
細胞間接着分子です。
インテグリンに結合する受容体です。
-
(*)P-selectin
〇血小板(14)
GMP-140またはCD62Pとも呼ばれる膜貫通糖タンパク質であり、
活性化内皮細胞または活性化血小板と白血球との
相互作用を媒介します。
細胞接着分子の一つです。
-
(*)A33抗原
〇腸細胞(4)
腸組織に発現される膜貫通糖たんぱく質で
免疫グロブリンスーパーファミリーの新規のメンバーです。
-----
<細胞表面ペプチダーゼ>
(*)ディぺプチジルペプチダーゼⅣ/CD26
〇腸細胞(4)
ディぺプチジルペプチダーゼⅣ/CD26は被膜に結合した
特徴的な多機能タンパク質で
受容体、タンパク質分解分子として働きます。
-
(*)アミノペプチダーゼn/CD13
〇マスト細胞(11)
亜鉛イオン依存の被膜結合エクトペプチターゼで
N-ターミナルニュートラルアミノ酸を持つ
タンパク質、ペプチドを分解する傾向にあります(18)。
-----
<テトラスパニン>
細胞膜を4回貫通する構造を持つ膜タンパク質で
細胞膜上でインテグリンや増殖因子受容体などと複合体を形成し,
機能を修飾することにより
細胞運動や細胞の活性化に関わります。
エクソソームのマーカーとして使われます。
(*)CD63
〇B細胞(12)
〇樹状細胞(3)
〇腸細胞(4)
〇血小板(14)
〇T細胞(6)
〇マスト細胞(15)
-
(*)CD37, CD53, CD81, CD82
〇B細胞(12)
-
(*)CD9
〇樹状細胞(10)
-----
<熱ショックタンパク質>
細胞が熱などのストレス条件下にさらされた際に発現が上昇して
細胞を保護するタンパク質の一群であり、
分子シャペロンとして機能する。
分子シャペロンとは機能を獲得するのを助けるタンパク質です。
(*)HSC70
〇網赤血球(16)
〇樹状細胞(10)
〇癌細胞(5)
-
(*)HSP84/90
〇樹状細胞(10)
〇腸細胞(4)
-----
<細胞骨格タンパク質>
(*)アクチン
〇樹状細胞(10)
〇腸細胞(4)
〇マスト細胞(11)
螺旋状の多量体を形成して
マイクロフィラメントの1種である
アクチンフィラメントを形作る球形のタンパク質です。
アクチンフィラメントは細胞の形を決定しています。
細胞質流動と、細胞分裂での収縮に関与しています。
-
(*)アクチン結合タンパク質(コフィリン)
〇樹状細胞(17)
アクチンフィラメントのダイナミクスを
制御するタンパク質です(19)。
-
(*)チューブリン
〇樹状細胞(17)
〇腸細胞(4)
真核生物の細胞内にあるタンパク質であり、
微小管や中心体を形成しています。
-----
<膜輸送と融合>
(*)アネキシンⅠ,Ⅱ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ
〇樹状細胞(17)
アネキシンはルシウムおよびリン脂質に結合する
タンパク質ファミリーで２０種類以上が見い出されている。
約７０アミノ酸残基からなるαヘリックスが４回
繰り返した構造であります。
細胞内外で多様なリガンドと相互作用、結合する
タンパク質です。
小胞の輸送にも関わり、
エクソサイトーシスやエンドサイトーシスにも関わります。
-
(*)アネキシンⅥ
〇マスト細胞(11)
-
(*)RAB7/RAP1B/RABGDI
〇樹状細胞(17)
Ras関連タンパク質Rab-7aは、
物質を細胞内に取り込むプロセスであるエンドサイトーシス
に関与しています。
-----
<信号伝達>
(*)Gi2α/14-3-3
〇樹状細胞(17)
-
(*)CBL/LCK
〇T細胞(6)
CBL細胞シグナリングとタンパク質のユビキチン化に関与する
E3ユビキチンリガーゼです。
Lckは、リンパ細胞内に見られる
56kDaのタンパク質です。
ナイーブT細胞とエフェクターT細胞の
両方でT細胞受容体シグナル伝達を活性化するために重要です。
-----
<代謝酵素>
(*)エノラーゼ-1
〇腸細胞(4)
エノラーゼ1は、一般的にアルファエノラーゼとして知られており、
ほとんどの組織で発現する解糖酵素です。
(*)チオレドキシン-ペルオキシダーゼ
〇樹状細胞(17)
チオレドキシン-ペルオキシダーゼ
チオール含有タンパク質で酸化ストレスの間
過酸化水素を分解するのに関与しています。
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Organ-on-a-chipの
細胞の培地、循環器、モニタリングについて
総括されています(1)。
その内容の一部、追記、考察を
読者の方と情報共有したいと思います。
//細胞の培地の選択//ーー
単一の細胞種のみがOrgan-on-a-chip装置内に含むときは
培地はその細胞種に対して従来から使われている培地
が選択されます。
しかし、複数の細胞種の時は
どの培地を選択するかに対して複雑になります。
複数の細胞種にとって最適に組み合わせた培地は
それぞれの細胞種に対して機能を維持する必要があります。
この評価基準を満たしたら、
望ましくない干渉がない下流のアッセイの中での
培地の適性を考える必要があります。
この最適化の中で
多くの研究グループはそれぞれの細胞種にとって
良い結果をもたらした培地の混合を採用してきました。
一緒に培養する異なる細胞種が増えていく中で
混合培地の最適化は難しくなります。
例えば、細胞種ごと被膜で区分けすれば
共通の培地を使う必要性がなくなります。
しかし、その被膜が微粒子を通す構造で有れば、
傍分泌の影響があります。
これは肝臓や皮膚のケース検討されています(2,3)。
//灌流//ーー
Organ-on-a-chipで循環器の役割を果たす流路を
灌流させることは一つの特質です。
これは栄養の供給と老廃物の除去の役割が主にあります。
灌流させる方法はいくつかあります。
〇conventional syringe pumps(4,5)
〇microvalve- driven actuator pumps(6,7)
〇peristaltic pumps(8)
〇hydrostatic pressure-based pump-free systems(9-11)
〇pump-free gravity-driven flows
これらです。
どのポンプ方法を選ぶかは
ワンパスタイプか循環型かで異なります。
ワンパスタイプは
syringe pumps、
pump-free gravity-driven flows
これらが適しています。
peristaltic pumpsは循環型の流路に対して
適性を有しています。
また
〇gravity-driven recirculatory flowsは
付加的な力が必要ではないため
システムを単純化できるというのがあります。
また循環型の中で
複数の臓器の相互作用を得ることもできます(11-15)。
流速はどの細胞種、組織、臓器をモデルにするかによって
その最適値は異なります。
それは流体によって生じる組織へのせん断応力を
どれくらいに設定するかを含みます。
--
ワンパスフローはフィードバックがないので
栄養を持続的に供給することができます。
しかし、組織間のコミュニケーションは
1方向に限られてしまいます。
循環型フローは
多臓器の相互のコミュニケーションを得る事ができますが、
持続的な栄養の供給が難しく、
老廃物も蓄積する問題があります。
特に循環型は
定期的な内容物の入れ替えが必要になります。
しかし、Organ-on-a-chipは
数日は入れ替えずに連続で作動させると言われています。
Organ-on-a-chipの流体の量は
固定的な組織と血液、間質液などの生体内の比を
参考にして設計されますが、
その流体の量は設計上限られる事があります。
前述した事と同様に液体も入れ替える必要があります。
--
上述したデザインと異なる方法として
1つのOrgan-on-a-chipからもう1つのそれへ
逐次的に条件付きで物質を輸送する
〇Functional coupling
これがあります(16,17)。
例えば、肝臓と腎臓の機能をカップリングさせる
ことが挙げられています。
しかし、このデザインは
即時的な相互作用をモニタリングするのには
適していません。
//循環器、微小環境の制御//ーー
Organ-on-a-chipでは細胞外ナトリックス、周皮細胞など
細胞の微小環境に関わる組織を
注意深く制御する必要があります。
組織を培養する形状に合わせる必要もあります。
また流体との物理化学的な減少は
マイクロスケールとなります。
その中で微小環境の正確な制御が必要になります。
マイクロ流体は
従来の細胞培地の液体とは異なる
物理化学的特性を持っています。
例えば、
〇気泡の形成
〇蒸発
〇栄養の枯渇
これらなどはマイクロスケール流体では
より強調される可能性があります。
また、
〇オスモル濃度
〇pH
〇栄養の利用性は
マイクロスケールでは劇的に変わる可能性があります。
またサイトカインやせん断応力などがの
生物化学的、機械的な作用が
どのように変わるかを理解する事も大切です。
物理的な流体の無次元数として
〇Rreynolds number (Re; inertial/viscous forces),
〇Péclet number (Pe; convective/diffusive transport)
〇Damköhler number (Da; diffusion/reaction timescales).
これらがあります。
これらは今述べたサイトカインやせん断応力が
どのようにマイクロスケールで組織に影響を与えるか？
を算出する上で参考となる係数です。
拡散と反応時間に比で示されるDaは
マイクロ流体では小さくなり
反応時間が支配的になります。
対流が反応時間に対して十分かどうかを示す
Pe/Daはサイトカインなどの生物化学的な物質が
十分組織間で相互作用するかどうかを測るためには
重要な係数となります。1よりも有意に大きい
数字となるように設計する必要があります(18,19)。
--
せん断応力や物質の輸送は流速が関わります。
自己分泌や傍分泌の要因を調べる研究では
全ての細胞のせん断応力を特性が劇的に変わる
閾値よりも下になるように流量設定する必要があります。
例えば、せん断応力に敏感な細胞は
〇胚幹細胞(<10^–3 dyne-cm^–2 )(18)
〇原発性神経細胞(<10^–3 dyne-cm^–2)(20)
〇肝細胞(<10^–1 dyne-cm^–2)(21,22)
これらです。
--
また組織間を流れる液体は血液としての働きもあるため
細胞、組織が生き延びるための最適な環境を
用意する必要があります。
〇酸素濃度(21%)程度
〇二酸化炭素(5%)程度
〇pH(7.0-7.4)程度
です。
意図的に低酸素状態を作る時には10%以下
とすることもできます(23)。
//モニタリング//ーー
Organ-on-a-chipが正常に保たれているかは
顕微鏡などを使って視覚的に継続的にモニタリング
する必要があります。
細胞、組織の大きさ、数、形
気泡や微生物汚染
これらなどです。
特に気泡は細胞を破壊することもあります。
従って、チューブなど連結部を
注意深くつなぐことと
空気圧を確実に抜く必要があります。
気泡が細胞や組織に影響がなければ、
無理に取り除かず、そのまま分散させたり
出口に逃がす事も考えられます。
しかし、多くの場合、
細胞や組織に影響を与える為、
流し出すなどをして積極的に取り除く必要があります。
細胞などを培養するときに
外部の気泡トラップなどを装備させ
エンジニアリングすることで
そうしたリスクを減らすことができます。
微生物汚染も実験の中断など
大きな影響を与えることがあるので、
適切な防止策を講じる必要があります。
//考察//ーー
Organ-on-a-chipは目的にも依りますが、
組織はできるだけ小さくしたいという需要があると思います。
細胞を大きく組織化させる事が難しいからです。
そうするとオーダーはマイクロスケールになり、
そこでの循環器系はマイクロ流体、
あるいはナノ流体になります。
上述したようにバルクの流体と異なるため
マイクロ流体、ナノ流体独自の困難性があると思います。
1つは、装置の耐久性があるかもしれません。
繰り返し、長く使うことができるか？
ということです。
身体の毛細血管というのは
大動脈とは異なり、閉塞してもバイパスする事ができるため
体内では血管生成を通じて、
時々閉塞しながらも恒常性は保たれていると考えられますが、
Organ-on-a-chipではそのリカバリー機能を
人為的に行う必要があることと
スケールが小さくなると
リカバリーを実施するハードルが上がることがあり、
耐久性に問題が出る可能性が考えられます。
(参考文献)
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生体内には様々なスケールで胞が存在します。
大きなスケールでは細胞があります。
その細胞内には細胞外小胞である
微小胞、腔内膜小胞などもあります。
またリソソームがあります。
それを膜に拡張すると小胞体を含めた
多くの細胞内小器官に存在します。
それらの胞は融合し、分裂します。
また膜とも融合します。
その際には近づき、接触する必要があります。
その接触は無作為に生じているわけではなく、
何らかの制御を受けて起こっています。
それに向性、走化性を与えるのが
小胞を含めた膜表面にあるタンパク質であり
その土台にはリン脂質であるホスフォイノシチドがあります。
細胞内の信号を受けて、
ホスフォイノシチド依存的に
様々なたんぱく質を引き付けます。
それで被膜接合部位ができ、
そこから物質の交換、移動、膜融合、分裂が生じます。
York Posor, Wonyul Jang & Volker Haucke
(敬称略)ら医療研究グループは
被膜融合部位(Membrane contact site)の
生理機序をホスフォイノシチドと結び付けて
総括されています(1)。
その内容の一部、追記、考察を
読者の方と情報共有したいと思います。
//被膜結合部位(*)//ーー
(*)Membrane contact site
細胞内小器官は被膜結合部位を通して
互いにコミュニケーションをしています。
例えば
〇脂質、イオンの交換
〇低分子量の代謝生成物のチャネル形成
〇被膜融合、分裂過程を促進
これらです(2,3)。
この被膜結合部位では
2つの細胞内小器官の被膜は
互いに引き合い、
例えば、10-30nmの距離にあります。
これはそれらを繋ぐ因子を通して
物理的に接続されていることによります。
この時、被膜の実体の確認において
重要な役割を果たすのがホスフォイノシチドです。
被膜結合部位は
〇ホスフォイノシチドの分布や代謝
〇他の脂質の分布や代謝
これらを制御します。
それは細胞シグナルや代謝合図に従って行われます(2,3)。
特に小胞体は重要な役割を果たします。
結合部位を形成します。
さらに、その機能は
細胞内小器官特異的なホスフォイノシチドの認識や
小胞体局在化被膜タンパク質の結合の
鍵となるアダプターを含みます。
//被膜結合部位形成の制御//ーー
リソソームなどを含む細胞内小器官の
被膜のリン脂質として存在するホスフォイノシチドは
被膜結合部位を形成するために
細胞内小器官同士をつなぐ
特異的なホスフォイノシチド結合タンパク質を
引き付けます。
小胞体と細胞膜では
〇synaptotagmins (E-Syts)
これが関わっています。
E-Sytsは
〇カルシウムイオン
〇脂質結合C2ドメイン
これらを通じて細胞膜と相互作用します。
これはPtdIns(4,5)P2に特異的に認識されます。
これによる結合は
カルシウムイオンレベルが上昇することによって
促進されます。
それがstore-operatedカルシウムイオン
エントリーを誘発します。
それは
〇小胞体タンパク質STIM1
〇細胞膜CaイオンチャンネルORAI
これらを通して生じます(4)。
STIM1-ORAIとE-Sytsは
カルシウムイオン制御性信号短路の一部です(5)。
この短路の中で
PtdIns(4,5)P2はE-Syt仲介被膜結合部位の形成を促進します。
一方で同時にPLCによって
ジアシルグリセロール(DAG)やIns(1,4,5)P3へ加水分解されます。
Ins(1,4,5)P3は
カルシウムイオン電導性Ins(1,4,5)P3受容体を
小胞体の中で活性化させます。
E-SytsはDAGを細胞膜から小胞体へ輸送させます。
このDAGはホスフォイノシチドを再合成する
前駆物質として機能します。
--
上述した機序と似た
ホスフォイノシチド依存性の機序が
小胞体、トランスゴルジネットワーク、
後期エンドソーム、リソソーム
いずれかの間の被膜接触部位の形成を支配します。
小胞体とトランスゴルジネットワーク
の被膜接触部位では
OSBPと脂質輸送タンパク質、例えば、CERT(6)。
これが
〇TGN上のPtdIns4PのPHドメイン
〇小胞体局在VAMP関連タンパク質(VAP)
これらを通して加わります(2)。
小胞体と後期エンドソームもしくはリソソーム
の被膜接触部位では
複数のホスフォイノシチド結合タンパク質が関与します。
1つの例では
〇FYVE domain-containing ER membrane protein protrudin
〇its associated factor PDZ domain-containing protein 8
これらによるリソソームPtdIns3Pの認識です(7)。
//被膜結合部位の脂質輸送//ーー
被膜結合部位の主要な機能は
タンパク質の機能によって脂質の輸送を行う事です(2)。
その方向性は脂質の濃度勾配によって生じます。
PtdIns4Pは特異的なPI4Ksを通して
ゴルジ複合体、細胞膜で合成されます。
結果として生じた
ゴルジ複合体と小胞体の間のPtdIns4Pの濃度勾配は
コレステロールのような脂質の輸送の動力となります。
それは小胞体からトランスゴルジネットワーク
さらには細胞表面まで輸送されます。
OSBPはトランスゴルジネットワーク内のPtdIns4Pに
小胞体を結合させます。
それはFFaTモチーフ、PHドメインを通して起こります。
それによってコレステロールの輸送が可能になります。
並列してPtdIns4Pは
トランスゴルジネットワークから小胞体へ輸送されます。
上述したCERT(6)や
PtdIns4Pアダプタータンパク質2(FAPP2)(8)は
セラミドやグルコシルセラミドを
小胞体からトランスゴルジネットワークへ
輸送するのを促進します。
--
似たPtdIns4Pベースの機序が
他の小胞体ベースの被膜結合部位でも作動します。
VAP–OSBPベースの被膜結合部位は
小胞体とリソソームの間で
コレステロールの輸送を作動させます。
エンドソームPtdIns4Pは
PtdSerを小胞体からエンドソームへ対向輸送させます。
これは OSBP-related ORP1Θを通じて生じます。
それによりエンドソーム分裂を促進します。
これはdynamin-related ATPase EHD1の作用によります。
PtdIns4Pと下流の生成物である
PtdIns(3,4)P2とPtdIns(4,5)P2は
リソソーム、ファーゴリソソームから
コレステロールを小胞体へ逆流させることができます。
--
被膜結合部位での脂質の輸送は
細胞信号、代謝によって制御されています。
哺乳類の細胞では小胞体からの
Ins(1,4,5)P3誘発カルシウム流出は
OSBPがトランスゴルジネットワークから
分離する原因となります。
それによって
細胞表面のコレステロールや糖脂質が不足します。
一方で、E-Sytベースの
小胞体と細胞膜の被膜結合部位の形成を促進します(9)。
従って、特徴的な被膜結合部位は
脂質輸送の制御のメカニズムを弱める働きが
あるかもしれないとされています。
--
被膜結合部位の脂質輸送の制御は
細胞信号を伴う
ホスフォイノシチド代謝の統合において重要です。
PLC-coupled受容体の活性化に反応して
PtdIns(4,5)P2はDAGとIns(1,4,5)P3に加水分解され
その不足が生じます。
そのPLCの活性の間で
ホスフォイノシチドの信号能力を維持するために
脂質輸送タンパク質Nir2が
小胞体と細胞膜の間の被膜結合部位で引き付けられます。
これらのVAPベース被膜結合部位では
Nir2が小胞体から細胞膜への
ホスフォイノシチドの輸送を強化します。
一方でPtdOHは小胞体へ輸送されます。
小胞体と細胞表面の間のPtdIns–PtdOH交換は
PtdInsからのPtdIns4Pの再合成を促進します。
それはPtdIns(4,5)P2の補充を可能にします。
それによってアゴニスト刺激に対する
持続的な反応性を確保します。
Nir2はゴルジPtdIns貯蔵を補充します。
それによってPtdIns4Pを持続的に合成できます。
これはPtdIns4Pとコレステロール循環の維持に必要です(10)。
--
(定義しにくい)被膜接触部位は
後期小胞体からインテグリン、Focal吸着キナーゼを含む
エンドソームへコレステロールを輸送出来ます。
これはOPP2を仲介します。
コレステロールの輸送は
〇PtdIns(4,5)P2
〇Focal吸着キナーゼ活性
〇細胞吸着
これらのエンドソーム合成を促進します(11)。
//フォスフォイノシチドのまとめ//ーー
ホスフォイノシチドのモニター、改変の
新しい儀重の発展によって、
その役割の一部が明らかになりました。
ナノスケールの局在化、代謝回転、動的機序です。
また細胞信号から受ける制御も同様です。
また、細胞内小器官同士が接触する事に寄る
物質の輸送、交換、融合、分裂の機序についても
明かになりつつあります(2)。
例えば、ミトコンドリアやエンドソームの分裂は
小胞体と被膜接触部位を形成する事に寄って
制御されるとされています
そこにはホスフォイノシチドPtdIns4Pが関与します(12,13)。
ホスフォイノシチドの型変換が制御されることで
細胞内でどのように細胞内小器官が働いているのか
その一部が明らかになりました。
新型コロナウィルスのようなウィルスに感染すると
ホスフォイノシチドの型を制御する
酵素の働きが改変されます。
従って、特異的な酵素の働きを抑える事で
(例えば、PIKfyve抑制薬 apilimod)
ホスフォイノシチド依存的な新しい形での
抗ウィルス薬の開発に貢献します(14,15)。
しかし、
特に不安定なで過渡的な
PtdIns(3,4)P2、PtdIns(3,5)P2からなる
ホスフォイノシチドを含めて
まだ明らかになっていない部分も多くあります。
代謝や代謝生成物循環との関係においても同様です。
その理解を高めていくためには
〇ホスフォイノシチドを視覚化するツール
〇CRISPR技術の発達
脂質改変酵素にタグをつけるため
〇ホスフォイノシチド結合タンパク質を
生きたまま分析するツール
これらが必要であるとされています(1)。
//考察//ーー
被膜結合部位は細胞内小器官同士の
特に小胞体と他の細胞内小器官代謝生成物などの物質の交換や
それらの分裂、融合などに関わっています。
それは細胞や小胞などで示される
表面リガンドのような物質で互いにテザリングされ、
細胞内小器官同士の接続の維持が可能になっています。
この結合タンパク質はホスフォイノシチド上にあるので
どのように動いて、どれを引き付けて
被膜結合部位を形成するのかは
ホスフォイノシチドが主に関わっていると考えられます。
細胞膜、小胞、細胞内小器官などの膜は
脂質とリン脂質からなりリン脂質は45%程度ですが
機能的な役割を果たしているのは
このうちリン脂質であり、
ホスフォイノシチドであると理解しています。
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Chak Ming Leung, Pim de Haan(敬称略)ら
医療研究グループは
Organ-on-a-chipへの適用の際に考慮に入れるべき
適切な細胞資源をどのように選択するか？
そのいくつかの評価基準を示されています(1)。
その内容の一部、追記、考察を
読者の方と共有したいと思います。
//患者さん特異性//ーー
Organ-on-a-chipを
個人、特定の患者さんなどに個別に合わせて
設計しようとしたとき、
その人の細胞や
その幹細胞由来の細胞が選択肢となります。
しかし、
特定の個人の細胞は
採取できるドナー細胞が限られる事と
組織から細胞を高純度で分離するための良い手順
がないことが挙げられます。
iPS細胞技術の発展(2)によって
患者さん由来の幹細胞を低侵襲でアクセスし
そこから任意の細胞種へ
その患者さんの遺伝子的な特徴を反映して
分化させる事が可能になりました。
そのiPS技術によって
個別化された(患者さんごとの)細胞、組織を
Organ-on-a-chipに搭載できます(3)。
//細胞の元来の機能性//ーー
Organ-on-a-chipに搭載した組織は
生体内に存在した時の組織の生理学を再現する
必要があります。
Organ-on-a-chipは
特定の人の細胞の組織に焦点を当てて
その詳しい評価を生体内にはない配置で
生体内ではできない解析を行います。
その前提として
Organ-on-a-chip内の組織は
生体内の生理機能を再現する必要があります。
しかし、実際には
多能性幹細胞由来の細胞も含めて
原発の細胞と比べて一部の機能しか反映しない
事が度々あります(4)。
原発の細胞はその機能維持のために
生体内で神経、免疫、栄養物など
補完物の影響を受けていると考えられるので
それを試験管に取り出して培養する過程で
組織特異的な機能が失われる可能性が
潜在的にあると考えられます(5)。
ドナー細胞は異種性があり、
かつ提供者が異なるとさらにそれはが大きくなります。
その中で比較のための
Organ-on-a-chip再現性の確保が難しくなります。
//増殖能力//ーー
Organ-on-a-chipでは組織を成長させる必要があります。
装置内の決められた区画内で
種細胞から成長させる場合もあります。
マイクロ流体デバイスの場合は
10^3～10^5個程度のオーダーの
少量の細胞量で作製することが可能ですが、
細胞量を増やしていく事は困難です。
なぜなら、細胞は増殖の過程で
少なくとも一定割合は細胞死していくからです。
iPS細胞は無限に増殖させていくことが可能ですが、
分化や細胞取得の際に多くの細胞が損失します。
細胞を死滅させないためには
栄養を常に届けるために液体チャネルの閉塞が
ないようにしておく必要があります。
//土台となる基質、間質細胞//ーー
基質、間質の線維芽細胞、周皮細胞、脈管構造などの
土台となる細胞はエンジニアリングした組織の
機能性に貢献します。
また病気の進行において重要な役割を果たします。
細胞外マトリックスも含めて基質、間質の
組織をOrgan-on-a-chipの中の
エンジニアリングした組織の中に入れる事は
細胞の信号や構造を変更させます。
また、調査する薬理も変わってきます。
さらに、癌、線維症などでは
基質、間質の状態も変わってきます。
その微小環境は病理、病態を変える為
Organ-on-a-chipでその疾患について調べるときには
例えば、癌細胞のみの組織ではなく
基質、間質を含めた微小環境の反映も考える必要があります。
//時間ウィンドウ//ーー
iPS細胞は特定の細胞種に成熟するためには
2～3週間程度かかると言われています。
皮膚、血液脳関門、腸上皮組織など
バリア組織を形成するときには
細胞同士の接着性を上げるためのセルシートに
再形成するため付加的な培養期間が必要です(6)。
長い時間培養するために
デバイスや作動は強固である必要があります。
//追加的に考慮する事//ーー
Organ-on-a-chipで特異的な組織において
生体内の機能を再現するためには
血液系、免疫系、内分泌系の機能の存在も必要です。
しかし、まだこれらの組み込みは
未成熟なままであるとされています。
また、(抹消)神経系もあると思います。
これは原理的に難しいかもしれません。
//考察//ーー
Organ-on-a-chipはオルガノイドの形成技術を
成熟させる事は重要ですが、
一方で、
その土台となる間質、基質
また相互作用を再現するマイクロ流路などの
循環器系などの再現も重要になります。
実質、間質、基質、循環器系は
生体内で独立することなく
相互作用しながら、特異的な組み合わせがあります。
例えば、腫瘍組織であれば
間質である細胞外マトリックスの構造や密度が異なります。
また土壌となる癌微小環境もあります。
それは基質に影響を与えます。
そのような全体的な再現は単純ではなく
複雑で、想定よりも困難であると考えられます。
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Author correction:目的の遺伝子配列探索の為の細胞内高頻度変異連続進化とその手法
目的の機能を持つたんぱく質などを得るために
指令された人為的な進化(Directed evolution)は
目的の遺伝子配列(Gene of interest)に対して
変異サイクル、増強、選択を適用する事によって
生物分子エンジニアリングに革新をもたらしました。
従来の指令された進化は
スケールや進化探索の深さにおいて
可能な範囲に制約されていました。
つまり、いくつかの適合性の中のバリアを
乗り越えられない遺伝子変異の連続性の低さがあった
ということです。
--
Rosana S. Molina, Gordon Rix(敬称略)ら
医療研究グループは生きた細胞内で
急速な変異、増強、選択を達成する
遺伝システムについて記述されています(1)。
それによって細胞が成長するにつれて
目的の遺伝子配列の進化を可能にしています。
これはタンパク質の進化とエンジニアリングにおいて
重要な研究領域となります。
本日はその背景部分の一部、追記、考察
について読者の方と情報共有したいと思います。
人を含めた生物は時間をかけて進化しますが、
それをミクロにみれば、
細胞レベルの進化の集合と言えます。
細胞内の拡散に変異が入る事によって
様々な機能をもつ生物分子が生成されるようになります。
このような進化を利用して
目的の遺伝子配列を持つ遺伝子に
人為的に進化させることを
Directed evolutionと呼びます。
このような指令された進化は
新たな機能を持つ生物分子をエンジニアリング
するために今まで追究されてきました(5,6)。
しかしながら、
〇バクテリア
〇酵母
〇人の細胞
これらのDNA複製の変異レートは
10^-10～10^-9 per baseとなっています(7)。
これは1kb程度の長さの遺伝子配列内で
変異が起こるには
おおよそ100万回～1000万回の細胞分裂が必要である
とされています。
目的とする遺伝子配列を好ましい形になるように
改善する遺伝子変異を得て、
それを増強、抽出する事は難しいとされています。
--
この指令された進化は
試験管内で多様な世代に変わり、
そこで高レートの変異では
〇error-prone PCR
〇randomized oligonucleotide pools
これらを
目的の遺伝子配列に与えてきました(6)。
結果として生じた目的の遺伝子配列(GOI)の変異は
細胞に形質導入され、
そこでRNAやタンパク質を表現し、
それら物質の選択、スクリーニングが行われます。
豊富にある、濃縮された目的の遺伝子配列(GOI)の変異は
〇試験管による多様化(細胞分裂)
〇形質転換
〇選択、スクリーニング
〇進化サイクルを進めること
の次のラウンドのテンプレートとなります。
--
指令された進化(directed evolution)は
生物分子エンジニアリングに革新をもたらしました。
とりわけ
〇蛍光タンパク質
〇酵素
〇抗体エンジニアリング
これらに対して革新をもたらしました。
しかし、アクセスできるスケール、深さに
制限がありました。
目的の遺伝子配列(以下GOIs)を急速に進化させ
かつ生体内でできるためには
細胞内で特定の遺伝子材料の高頻度変異を目的とする
必要があります。
一方で、多くの宿主遺伝子は残す必要があります。
これは特定の遺伝子だけを細胞内で
高頻度変異をさせるということです。
それを維持させるためには選択性以外にも
耐性がある必要があります。
このような耐性ある連続的な進化は
厳しい適合性を必要とする長い変異経路を
超える事ができます。
それによって目的とする生物分子標的(depth：深さ)
に達する事ができます。
研究者は多くのGOIsを並列に動かすか
1つのGOIsに対して多くの複製を作るか
を選択することができます。
それによって
〇多くの標的機能に達する事
〇進化のルールを把握する事
〇遺伝子配列と機能のマップを作る事
これらを統計的にすることができます。
--
生体内での連続的な進化のタイプは
〇ウィルスシステム
〇細胞システム
これらに分けられます。
ウィルスシステムではファージが変異を
アシストします。
ウィルスシステムの適合性は
細胞のそれに依存する必要がありますが、
細胞システムはそのものの適合性を
利用することができます。
ウィルスは抗ウィルス抵抗性などによる
変異を利用することもできます。
しかし、ウィルスは
細胞そのもので連続的な進化をさせるよりも
細胞に寄生する形でGOIを制御する必要があるため
細胞そのものよりも複雑であるとされています。
一方、細胞は
培養の容易性、アクセス性の高さ
進化実験のスケール性の高さ
などが利点として考えられます。
Rosana S. Molina, Gordon Rix(敬称略)らは
ウィルスではなく細胞を使った
生体内でのGOIsの連続的な進化について
焦点を当てられています(1)。
特に近年発展してきた
〇OrthoRep
〇MutaT7
〇EvolvR
これらの方法に焦点を当てています。
-
OrthoRepは
Error-prone DNAポリメラーゼ(DNAP)が
GOIをエンコードした線状プラスミドを複製します。
このDNAポリメラーゼは染色体の遺伝子や
宿主のDNAポリメラーゼは線状プラスミドを
複製しません(8,9)。
-
MutaT7は
核酸塩基デアミナーゼが
T7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)に融合します。
T7RNAPはGOIの隣に位置するT7プロモーターを引き付けて、
デアミナーゼがGOIを遺伝子修正します。
--
EvolvRは
Error-prone DNAポリメラーゼ(DNAP)と
ニッカーゼCas9(nCas9)を融合させます(10)。
ガイドRNAで示された標的サイトで
nCas9は単鎖DNAを破壊し、
Error-prone DNAPが
低い忠誠度とプロセッシビティーで伸長します(11,12)。
この時に高頻度で変異が入ると理解しています。
--
適所でこれらの方法によって
高頻度変異が入るシステムを伴った状態で
もし、GOIの活性が細胞の適合性上昇とリンクしたら
選択淘汰される中において培養する細胞は
改善されたGOI変異の進化をしたと言えます。
//細胞種特異的輸送系統(*)の観点//ーー
(*)Cell-type-specific delivery system
Zhongyi Hu, Jiao Yuan(敬称略)ら
医療研究グループは、
Surfaceome、表面タンパク質
この数千種類のデータベースの中から
癌細胞に特異的なたんぱく質を409種類見つけています。
例えば、CDH1, CDH3などは数種類の癌で
特異的な表面タンパク質として検出されています(2)。
このCDH1, CDH3に特異的に結合する
表面リガンドをナノ粒子や細胞外小胞に装飾する事が
細胞種特異的輸送系統の目的です。
この時に考えないといけないのが
①CDH1, CDH3との結合親和性
②そのタンパク質と遺伝子配列の関係
③その遺伝子配列を持つ遺伝子の生成、抽出
これらです。
例えば、
H. Tomas Rube(敬称略)らの
結合親和性と遺伝子配列を繋ぐコンセプト(3)や
タンパク質の構造予測から
タンパク質の構造と遺伝子配列を繋ぐ技術(4)。
これらによって①と②が解決したとしても
その遺伝子を作る必要がありますし、
細胞外小胞ならば、表面に発現する必要もあります。
その時に目的の遺伝子配列(GOI)が分かった状態で
それと一致する遺伝子配列を持った遺伝子を
どのような出発点、テンプレートから探索するか？
それと配列数が同じで
記号が近い遺伝子配列の物を選ぶのか？
そこが疑問としてあります。
//Risk science//ーー
以前、CRISPR Cas9によって遺伝子編集が可能になった時、
そのリスクについても同時に議論になったと思います。
その扱いについて世界的にどこで落ち着ているのか？
というのは調査が必要ですが、
少なくとも遺伝子学に関わる研究分野では
その技術が使われ、あるいは派生して、
日進月歩で科学技術が発展しています。
今回の高頻度変異を目的のタンパク質を得るために
生物内で利用する内容において、
すぐに世界から大きな反応がありました。
そのように受け取っています。
それは主にリスクについてです。
そのリスクについては多面的に理解しています。
上述した遺伝子編集技術なども含めて
医学生理学、医療工学だけではなく、
物理、化学、工学分野においても
その技術発展に伴うリスクは
広範にみれば必ず存在します。
ただ、今回の記事において
特別、世界から一斉にそのような反応があったことは
そのリスクについてより深く考える必要性を与えます。
少なくとも国際的、学際的な議論は必要です。
(参考文献)
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リソソームは細胞内の物質の消化に関わる
細胞内小器官なので
細胞の栄養状態に応じて
その働きが変わることが考えられます。
York Posor, Wonyul Jang & Volker Haucke
(敬称略)からなる医療研究グループは
リソソームの機能を中心として
栄養状態、ホスフォイノシチドとの関連について
総括されています(1)。
本日はその内容の一部、追記、まとめについて
読者の方と情報共有したいと思います。
//リソソームとホスフォイノシチド//ーー
リソソームは多様な型のホスフォイノシチドを有しています。
それは細胞の機能、代謝状態に依存して
独特な役割を担うことと関連しているかもしれません。
オートファゴソーム、エンドソーム機能を制御する
PtdIns3Pに加えて、
リソソームはPtdIns(3,5)P2、PtdIns5Pを有しています。
これらのホスフォイノシチドは
〇リソソーム
〇後期のエンドソーム(多胞体)
〇他のリソソーム関連細胞内小器官
これらに対して特異的であると考えられます(2,3)。
一方、
リソソームは
PtdIns4P、PtdIns(4,5)P2からなる
ホスフォイノシチドは多くは含まず、
これらはゴルジ複合体や細胞膜に多く含みます(4-6)。
PtdIns(3,4)P2は希少なホスフォイノシチドです。
これはリソソームの機能を制御するかもしれません(7,8)。
これらの異なるホスフォイノシチドを含むことは
リソソームの機能状態と関連しています(9)。
//リソソームの動的機序と栄養信号//ーー
リソソームは代謝信号ハブとして重要な役割があります(9)。
〇インスリン
〇成長因子信号
〇栄養の利用性
これらはmTORC1によって統合され
異化と同化経路の均衡状態が保たれます。
mTORC1は複数のタンパク質
〇kinase mTOR
〇distant relative of the PI3Ks
〇regulatory-associated protein of mTOR(Raptor)
〇additional subunits
これらから成ります。
細胞やリソソームのアミノ酸の状態に反応して
Rag small GTPasesによってリソソームに引き付けられます。
--
ホスフォイノシチドは
リソソームの mTORC1活性を制御します。
それにより任意の細胞内サイトで
栄養物質の代謝を制御します。
細胞膜でインスリンや関連受容体が
一旦リガンドに結合すると
class I PI3Ksを活性化させ
PtdIns(3,4,5)P3を生成させます。
引き続いてエフェクタータンパク質キナーゼAKT
を脂質仲介で活性化させます。
細胞表面でのこのAKTの持続的な活性化は
PtdIns(3,4,5)P3からPtdIns(3,4)P2への
加水分解によって達成されます(7)。
この活性化されたAKTは間接的に
mTORC1活性を刺激します。
これはリソソーム結節硬化複合体2(TSC2)の
リン酸化反応による抑圧によって生じます。
また
mTORC1-activating RHEB GTPase。
これも関与します(7,9)。
--
mTORC1活性とリソソームの動的機序は
リソソームのホスフォイノシチドによって
局所的に制御されています。
例えば、
PtdIns3P, PtdIns(3,4)P2、PtdIns(3,5)P。
これらです(10)。
PtdIns3P生成キナーゼVPS34は
mTORC1の活性を必要とします。
mTORC1の活性のPtdIns3Pの仲介は
小胞体とリソソームの膜接触の形成が必要で
リソソームmTORC1が細胞周辺へ転座する必要があります。
そこでインスリン、成長因子信号が起こります(11)。
このメカニズムは
〇小胞体被膜タンパク質のprotrudinと
リソソームPtdIns3Pの接続、
〇PtdIns3P結合タンパク質FYVE
coiled-coiledドメイン含有タンパク質FYCO1
これらのリソソームへの引き付け
これらが必要です。
これはリソソームのキネシンによる輸送を
誘発するために必要です(12)。
protrudinとFYCO1のどちらが欠損すると
mTORC1活性は抑制され、
細胞核のTFEBレベルが増加します。
この事は
〇ホスフォイノシチド
〇mTORC1
〇リソソーム恒常性、動的機序
これらが密接に相互に関連している事を示しています。
--
PtdIns3Pがリソソーム機能と動的機序を制御している
第二のメカニズムはPIKfyveを通して
PtdIns3PからPtdIns(3,5)P2を生成している事に関係します。
PtdIns(3,5)P2はmTORC1-inhibitory TSCの
膜への引き寄せを促進するものです。
異なる細胞種でmTORC1制御における
PtdIns(3,5)P2の対立的な役割が
どのように調整されるか？
というのはさらなる研究が必要です。
--
Class III PI3K VPS34によるPtdIns3Pの生成は
mTORC1を亢進し、リソソームの分散を誘発します。
一方、
Class II PI3K PI3KC2βによるPtdIns(3,4)P2の
リソソーム貯蔵の局所的な生成は
反対の役割を有します(8)。
成長因子が不足した状態では
PI3KC2βは
リソソーム上のmTORC1 subunit Raptorを引き付け
PtdIns(3,4)P2を生み出すために
PtdIns4Pをリン酸化します。
PtdIns(3,4)P2合成はmTORC1信号を抑制します。
これは
〇inhibitory 14-3-3 proteins(8)
これの引き寄せ
〇oxysterol-binding protein (OSBP)-related protein 1 long isoform(ORP1L)-mediated transport of cholesterol
〇mTORC1活性のimportant cofactor
この働きを促進することで生じます(13)。
リソソームのPtdIns(3,4)P2は
リソソームが微小管形成中心へ逆行性輸送する事を促進します。
mTORC1信号のPI3KC2β仲介抑制は
細胞の栄養状態が改善すると緩和されます。
それは
〇タンパク質キナーゼN仲介リン酸化
〇PI3KC2βの複合体形成
これらに依ります(14)。
リソソームのPtdIns(3,4)P2のエフェクタータンパク質は
ほとんどわかっていません。
その中で
PtdIns(3,4)P2はsmall GTPasesの活性循環に影響を与えます。
そのことはリソソームを
ダイニン、キネシンんモーターにリンクさせます。
それによってリソソームの位置とmTORC1活性を制御します(9,15)。
これはリソソームとキネシン接続を促進する
ADPリポシル化因子様8(ARL8)を含みます。
また、リソソームをダイニン、キネシンモーターに
接続するRAB7を含みます(16-18)。
しかし、
リソソームの位置取りとmTORC1の活性が
どのように機械的に関わっているかは
まだほとんどわかっていません。
--
総合すれば、上述したことは
局所的なホスフォイノシチド信号が
栄養信号、代謝とリソソーム動的機序と
どのように関連するかを説明するものです。
例えば、PtdIns(3,4)P2の働きは
単一の脂質が細胞膜か、リソソームにあるかによって
mTORC1活性の亢進、抑制の異なる効果を
どのように持つかを説明するものです。
//細胞飢餓時のリソソームの再形成//ーー
細胞が長引く飢餓状態にあると
リソソームとオートリソソームはチューブ状になり
小さくて、未成熟のリソソームである
プロトリソソームとして発芽します。
この経路は
Autophagic lysosome reformation
と呼ばれます。
これは
PtdIns(4,5)P2とPtdIns3Pを含む
多数のリソソームのホスフォイノシチド種によって
制御されます。
これらはリソソームの再形成の特徴的な段階で作用します。
長期の飢餓状態は
PIPKIアイソフォームによって
オートリソソームのPtdIns(4,5)P2の合成を誘発します(19)。
PtdIns(4,5)P2はリソソームのチューブ化を誘発します。
それはキネシンとクラスリンAP2コート物質の
引き寄せによって生じます。
そして、このチューブ状の中間物質から
プロトリソソームの発芽形成を促進します(20)。
このリソソームチューブ化は
PtdIns(3,5)P2合成によっても促進されます(21)。
プロトリソソームの小胞は
クラスリンAP2コートチューブから摘み取る事に寄って
形成されます。
それは膜分裂酵素ダイナミン2が
PtdIns(4,5)P2に制御される事によって生じます(22)。
//まとめ//ーー
リソソームの栄養状態の監視や
栄養状態に応じたリソソームの動的機序は
様々な物質が関与しますが、
ほぼ共通してホスフォイノシチドが間接的に関与しています。
ホスフォイノシチドがリン酸化などを通じて
適切な型に変わることで
様々栄養状態に対するリソソーム恒常性、
ひいては細胞の恒常性が築かれると考えられます。
(参考文献)
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保っていると言えます。
摂餌すれば、尿や糞便などによる排出があります。
熱の循環もあります。
そうした循環は細胞レベルで行われています
不要な物質を分解して、排出する機能です。
その分解を担っているのがオーファジーであり
リソソームです。
従ってリソソームの機能を理解する事は
人を含めた生物の基礎的な循環の一部を
理解する事になります。
York Posor, Wonyul Jang & Volker Haucke
(敬称略)から成る医療研究グループは
オートファゴソームとリソソームの
生成プロセスと融合について総括されています(1)。
その内容の一部、追記、まとめを
読者の方と情報共有したいと思います。
//オート-リソソームシステム//ーー
リソソームは動性に富んだ細胞内小器官で
細胞内外の物質を分解させる働きを持ちます。
それは内腔の酸性分解酵素によって生じます。
リソソームとリソソーム関連細胞内小器官は
他の機能も持っています。
〇加水分解酵素、細胞毒素などの分泌
〇代謝信号ハブ
これらなどです。
リソソームは多様なホスフォイノシチドを有します(2,3)。
--
細胞外の物質は融合を通じて
エンドサイトーシスの経路で
リソソーム内腔へ輸送されます
〇凝集された細胞内タンパク質
〇欠陥のある細胞内小器官
〇病原体は
オートファジーを通して
リソソームによる分解の標的となります。
このオートファジーは小胞体の特定の部位に
PtdIns3Pを合成する事によって
新たに膜を形成します。
//オートファゴソーム形成//ーー
オートファゴソームの形成は
オートファジー関連タンパク質を含む
複数の複合体によって生じます。
オートファゴソームの前駆体は
ファーゴフォアー(phagophore)と呼ばれ
小胞体のPtdIns3Pを豊富に含む部位から生まれます。
ファーゴフォアーは拡張し、閉じ、
それによって成熟したオートファゴソームを形成し
最終的にリソソームと融合します。
--
オートファジーは
〇UNC-51-ULK1複合体の活性
〇mTORC1の不活性
これらによって生じます。
小胞体でファーゴフォアー発生部位に
ULK1複合体が転座することは
PI4KIIIβの輸送によって促進されます。
それはPtdIns4Pの
局所的な貯蔵を生み出すために生じます(4)。
活性なULK1はVPS34 complex Iの引き寄せを促進し
PtdIns3Pの局所的な生産に寄与します。
PtdIns3Pのオートファジー貯蔵は
PI3KC2αを含むclass II PI3Ksによって生成されます。
それは特異的な細胞の環境(シェアストレスなど)によって生じます。
PtdIns3Pは様々なPtdIns3P結合タンパク質を
引き寄せるための信号分子として機能します。
そのPtdIns3P結合タンパク質は
〇double FYVE domain-containing protein 1 (DFCP1),
〇autophagy-linked FYVE protein (ALFY)
〇WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein (WIPI) family of scaffold proteins
これらです(5)。
PRoPPiNドメインを通したWIPI2は
オメガサム(ファーゴフォアー)でPtdIns3Pに結合します。
それはATG12–ATG5–ATG16L1複合体を引き寄せます(6)。
この複合体は
ubiquitin-like lC3 familyタンパク質と
phosphatidylethanolamineの結合のための
E3-likeリガーゼとして働きます。
WIPI2とVPS34 complex Iは互いに引き寄せあい
PtdIns3PとLC3の正のフィードバックループを生みます。
これはファーゴフォアーの拡張、閉膜にとって重要です。
PtdIns3Pが豊富にある部位には
lipid transfer protein ATG2を通したWIPI4は
小胞体を拡張したファーゴフォアにつなぎます。
その拡張に必要なリン脂質の転換を可能にします。
--
PtdIns3Pの生成はオートファージの発生に必要ですが、
リソソーム分解による除去は経路を完了するための
必要条件であるとされています(5,7)。
オートファジーの後期課程の
PtdIns3Pの加水分解は
MTMRタンパク質によって仲介されます。
これらのホスファターゼの欠乏は
〇X-linked centronuclear myopathy
〇Charcot–Marie–Tooth disease
を含む疾患と関連します(8)。
//オートファゴソーム-リソソーム融合//ーー
多数のフォスフォイノシチドは
オートファゴソームとリソソームの
連結と融合を制御します(9)。
オートファゴソームは
〇VPS34 complex I由来PtdIns3P
リソソームは
〇VPS34 complex II由来PtdIns3P
〇PIKfyve complex由来PtdIns(3,5)P2
これらをそれぞれ豊富に含みます。
このうちリソソームの
PtdIns(3,5)P2の合成と代謝回転は
オートファゴソーム-リソソーム融合において
重要な経路であるとされています。
リソソームのPtdIns(3,5)P2のエフェクタータンパク質は
〇actin-associated protein cortactin(10)
〇lysosomal calcium release channel mucolipin(11)
〇twin pore channel 2 (TPC2)(12)
〇PX domain-containing protein SNX14(13)
これらが想定されています。
--
オートファゴソーム-リソソーム融合は
PI4KIIαのリソソーム貯蔵による
PtdIns4Pの合成も必要とします(14)。
リソソームでは
PtdIns4PがさらにPtdIns(4,5)P2に
リン酸化されます。
リソソームPtdIns(4,5)P2は
リソソームカルシウム放出チャネルmucolipin 1
を抑制します。
これは多くのリソソーム、オートファジー遺伝子を
制御すると言われています。
しかし、リソソームPtdIns(4,5)P2の機能は
よくわかっていません。
--
リソソームによるホスフォイノシチド並列経路
〇PtdIns3P–PtdIns(3,5)P2
〇PtdIns4P–PtdIns(4,5)P2
これらの合成、回転代謝の制御は特異的ですが、
オートリソソーム形成のステップとして
まだ理解されていない部分が多くあります。
//まとめ//ーー
York Posor, Wonyul Jang & Volker Haucke
(敬称略)らがFig.3に示すように
小胞体からファーゴフォアを介して
形成されたオートファゴソームは
その膜のリン脂質としてPtdIns3Pを含みます。
一方リソソームでは
多様にフォスフォイノシチドを含む中で
〇PtdIns3P–PtdIns(3,5)P2
〇PtdIns4P–PtdIns(4,5)P2
4種類のフォスフォイノシチドが複雑に関与しながら
オートファゴソームとリソソームの
融合に関与すると考えられます。
従って、精巧に制御された様式で
これらの過程が生じると考えられます。
しかし、図中も含めて記述されているように
どの様に複数のフォスフォイノシチドが
タンパク質信号なども含めて関わっているのか？
という事はわかっていません。
(参考文献)
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York Posor, Wonyul Jang & Volker Haucke
Phosphoinositides as membrane organizers
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Rab7 and PLEKMH1 membrane cycling during
autophagosome-lysosome fusion. EMBO J. (2019).
例えば、半導体であるGaAsは
トリメチルガリウムとアルシンを前駆物質として
気相成長法によって基板上に成長して作製することができます。
しかし、当然、陽子、電子から作ることはできませんし、
ガリウムそのものと、ヒ素そのものから合成することも難しいです。
これは構成としてはシンプルな無機材料ですが、
それが有機になればもっと複雑になります。
高分子になればなおいっそうそうです。
その高分子の集まりである細胞ならどうか？
自然の力を借りる事なくしては作る事はできません。
細胞内小器官、細胞外小胞、膜を一つ一つパーツとして
人工的に組みあげることはできません。
それは、細胞内の重要な構成要素である
遺伝子(DNA,RNA)でも同じです。
そういった中で
おそらく医学生理学、生物学は
「逆問題」が非常に難しいと考えられます。
つまり、タンパク質を任意にコンピューターグラフィックスで
組み立てて、それを遺伝子から作ることができるか？
おそらくそれは難しいと考えられます。
その「逆問題」を細胞種特異的輸送系統
(Cell-type-specific delivery system)
において世界に問うていることになっています。
つまり、標的とするリガンドの特定の結合部位に
結合親和性の高いタンパク質を作ることができますか？
ゴールのビジョンは明白ですが、
これは完全に逆問題となっています。
順問題のように
「この遺伝子から表現される物質は何ですか？」
というのと逆です。
従って、偶然できるのを待つしかない部分もあります。
Rosana S. Molina, Gordon Rix(敬称略)ら
医療研究グループは
生体内で高頻度変異に対する手法を総括されています(1)。
この高頻度変異の中で生み出された
遺伝子(DNA, RNA)を逃さずに取り出して、
生みだせるタンパク質の貯蔵を増やそうという考えに及びます。
概要の部分で
"These systems advance the scale, evolutionary search depth, ease and overall power of directed evolution and access important new areas of protein evolution and engineering."
と記されています(1)。
この最後のエンジニアリングには
上述したような逆問題の難しさが背景があるのではないか
と推測しました。
考えてみれば、逆問題はどの物理分野でも難しいです。
量子ドットのようにエネルギー的なくぼみを
フロケ結晶のように作って、
そこに回転の逆の電子ペアを入れて
マイスナー効果を満たす空間を作ることができるか？
その形はわかっていても、
それを作ることは容易ではありません。
結果的に、偶然できたという事も多くあります。
医学生理学、生物学の場合には
特定の逆問題を解くための方法に関与する
原材料、前駆物質は
生物に作ってもらうというのが
1つの有効な方法であると考えます。
(参考文献)
(1)
Rosana S. Molina, Gordon Rix, Amanuella A. Mengiste, Beatriz Álvarez, Daeje Seo, Haiqi Chen, Juan E. Hurtado, Qiong Zhang, Jorge Donato García-García, Zachary J. Heins, Patrick J. Almhjell, Frances H. Arnold, Ahmad S. Khalil, Andrew D. Hanson, John E. Dueber, David V. Schaffer, Fei Chen, Seokhee Kim, Luis Ángel Fernández, Matthew D. Shoulders & Chang C. Liu
In vivo hypermutation and continuous evolution
Nature Reviews Methods Primers volume 2, Article number: 36 (2022)
細胞表面には細胞種特異的な表面リガンドがあります。
その表面リガンドはおおよそ分析する事が可能である
と理解しています。
CD**など名称がつけられています。
それと結合する抗体なども含めタンパク質がありますが、
結合親和性の高いペアは人工的に設計されたものではなく
実際の自然の分析結果から経験的に見つけられたものである
と認識しています。
従って、
細胞種特異的輸送系統
(Cell-type-specific delivery system)で
癌細胞特異的な表面リガンドを見つけたとしても
それと対になるたんぱく質が見つからない
あるいはその設計方法がわからない
ということがあると理解しています。
さらに、そのたんぱく質を遺伝子的にどう作ればいいか？
つまりどのような遺伝子配列であればいいか？
というのもわかりません。
その遺伝子配列とタンパク質の関係を調べるときには、
タンパク質に翻訳される前に
転写過程でDNAどの遺伝子情報を認識するか？
(sequence recognition)
これも重要な項目になります。
この転写過程においては
転写開始因子(σ因子)とRNAポリメラーゼとの複合体(2)によって
DNAの特異的な部位(プロモーター)を認識し
結合して、遺伝子情報を認識して、
mRNAが作られ、タンパク質に翻訳されます。
つまり、転写過程では
特異的な部位、配列を認識することになります。
全遺伝子配列から結果として生じる任意のタンパク質に
対応するプロモーターがどこにあるのか？
それを事前に予測する事は少なくとも難しい
と理解しています。
--
H. Tomas Rube(敬称略)らは
機械学習の方法を用いて、
最終的に翻訳されるたんぱく質と任意のリガンドの
結合親和性と
上述した転写因子がDNAのどの配列を認識するか
という配列認識の関係を正確に定義する事が
できた(1)と理解しています。
(※解離定数に関わるKD-seqと合わせる)
従って、
遺伝子配列から細胞種特異的な表面リガンドに
どれくらいの結合親和性を持ったタンパク質が生じるか？
といったことが予測できる
ということです。
これが実際の実験結果と
平衡状態でどれくらい整合性があるか？
タンパク質の構造予測のように
正確性が高いか？という疑問もあります。
例えば、Fig.4dではショウジョウバエのケースで
高いことが示されています(1)。
一方、
認識された配列と特定のリガンドに結合親和性の高い
タンパク質のペアがわかったとしても、
転写開始因子(σ因子)とRNAポリメラーゼとの複合体を
その特異的な遺伝子配列に制御して結合させる事ができるのか？
という疑問があります。
(参考文献)
(1)
H. Tomas Rube, Chaitanya Rastogi, Siqian Feng, Judith F. Kribelbauer, Allyson Li, Basheer Becerra, Lucas A. N. Melo, Bach Viet Do, Xiaoting Li, Hammaad H. Adam, Neel H. Shah, Richard S. Mann & Harmen J. Bussemaker
Prediction of protein–ligand binding affinity from sequencing data with interpretable machine learning
Nature Biotechnology (2022)
(2)
Dmitry G. Vassylyev, Shun-ichi Sekine, Oleg Laptenko, Jookyung Lee, Marina N. Vassylyeva, Sergei Borukhov & Shigeyuki Yokoyama
Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution
Nature volume 417, pages712–719 (2002)
細胞内への物質の取り込みは
細胞の生存における一つの主要な生理です。
その取り込みの中で
エンドサイトーシスを介した小胞が関わる事が
主要な経路の一つです。
従って、その小胞の動的機序を理解する事は
細胞内外での物質の交換過程を理解する上で
非常に重要になります。
その交換過程に関わる
細胞内の小胞であるエンドソームの機序について
York Posor, Wonyul Jang & Volker Haucke
(敬称略)からなる医療研究グループは
総括されています(1)。
その内容の一部、追記、考察(疑問)を
読者の方と共有したいと思います。
//エンドソームの動的機序//ーー
エンドサイトーシスによる細胞内浸入の後
その小胞は初期のエンドソームと会合、融合します。
それで小胞は大きくなり、成長します。
エンドサイトーシス小胞の輸送物、構成物は
〇細胞膜に再生利用されます。
〇トランスゴルジネットワークに輸送されます。
〇後期の多胞体となります。
〇リソソームによって分解されます。
このように複数の運命を持っています。
エンドソームを示すホスフォイノシチドは
PtdIns3Pです。
これは
〇sole class III PI3K VPS34
〇class II PI3Ks(関与は低い)
こられによってPtdInsから合成されます。
それは細胞種によります(2,3)。
//初期エンドソームの生理//ーー
〇Small GTPase RAB5
これは初期エンドソームの維持、機能において
重要な役割を持ちます。
このRAB5の活性は
〇RME6
〇GEF
⇒これはクラスリンAP2脱コート化と
PtdIns(4,5)P2喪失を結びつけます(4)。
これらによって
エンドサイトーシス小胞の形成と関係します。
この初期エンドソームのRAB5の活性は
〇RAB5 GEF Rabex 5
〇RAB5–GTP-associated VPS34 complex II(5)
〇PtdIns3P
〇RAB5 effector Rabaptin 5
⇒これはRabex 5を複合体化します。
これらによって制御されます。
これらの生理経路は
初期のエンドソームに特徴的な
RAB5–GTP、PtdIns3Pを豊富に含む
膜環境を生みだし、維持します。
これら
RAB5–GTP、PtdIns3Pの認識は
同型の初期エンドソーム融合の基礎となります。
あるいは
〇エンドサイトーシス小胞の輸送の維持
〇初期エンドソーム膜の恒常性の維持
これらに必要な反応の基礎となります(6)。
--
RAB5エフェクターは
〇5-phosphatases OCRL
〇INPP5B
〇PtdIns(3,4)P2 4-phosphatases INPP4A
〇INPP4B
これらを含みます。
これはホスフォイノシチドをPtdIns3Pを
変換させる役目があります。
--
膜融合に加えて
エンドソームPtdIns3Pは輸送物の運命に関わります。
PtdIns3Pを豊富に含むエンドソーム内に
内包化された輸送物が到着すると
サブドメインに分離しようとします。
その中で回復、維持、もしくは劣化の
仕分けが行われます(7)。
--
初期エンドソームは
エンドサイトーシスで形成された小胞の
同型の膜融合によって形成されます。
(参考文献(1) Fig.2c)
//エンドサイトーシスのリサイクリング//ーー
エンドサイトーシスリサイクリングの間
被膜はPtdIns3Pを含むエンドソームから
PtdIns4P/PtdIns(4,5)P2を豊富に含む
細胞膜へ戻されます。
この細胞膜はエンドソームから
タンパク質複合体を通じて
チューブ状の小胞輸送体
(tubulovesicular carriers)
これを介して引き戻します。
このタンパク質複合体は
〇Retromer
〇Retriever
〇ESCPE-1
これらを含みます。
これらの引き戻し複合体は
特定の仕分けモチーフを含む輸送体をクラスター化します。
そのクラスターの密度が閾値に達すると
被膜がチューブ状に形成されます。
それは
〇BAR domain-containing SNXタンパク質
〇Wiskott–Aldrich syndromeタンパク質
〇SCAR homologue(WASH)-dependent branched F-actin formation
これらの連携によって形成されます(8,9)。
これらの取り戻し複合体は
PtdIns3Pによってエンドソームに標的化されます。
Retromerは
SNX3 or SNX27を持つカーゴたんぱく質の
再生利用の中で作動します。
SNX3、SNX27は両方
PtdIns3P-binding PX domain
これを含みます(8)。
Retriever、ESCPE-1は
それぞれSNX17、SNX1/2によって
似た役割を果たします(9-11)。
PtdIns3Pレベルの制御は
細胞膜へ再生利用する機序に関わる物質を
通して行われます。
PtdIns3Pレベルの上昇は
VPS34に依存します。
また
エンドソーム構造の
WASH複合体、Fアクチンの蓄積に関係します(12)。
PtdIns3Pの特徴的な貯め込みは
RAB11-positiveエンドソームのPI3KC2αに合成されます。
これはエンドサイトーシスのリサイクリングにも
関与します。しかし、その物理はよくわかっていません。
--
WASH複合体の機能は
〇PI4KIIα/β
〇小胞体-エンドソーム接合部位(13)
これらを通して
PtdIns4Pによる制御に従います。
これはエンドソームの回復が
PtdIns3PからPtdIns4Pへのホスフォイノシチド変換
に関係しているかもしれない可能性を示唆します。
エンドソームから回復するとすぐに
輸送物はPtdIns4Pを豊富に含む目的地である
トランスゴルジネットワーク、細胞膜
どちらかに輸送されます(8)。
リサイクリングされた小胞のエクソサイトーシスは
ホスフォイノシチド変換モジュールである
〇PtdIns3P phosphatase MTM1
〇PI4KIIα
〇Exocyst complex
これらを必要とします(14)。
このMTM1が失わえると
リサイクリング小胞は細胞膜と融合する事ができません。
--
従って、エンドソームから細胞膜へのリサイクリングは
被膜のリン脂質であるホスフォイノシチドが
PtdIns3PからPtdIns4Pへ返還される事を必要とします。
//エンドソーム成熟//ーー
エンドソームに陥入して腔内膜小胞を形成する過程は
ESCRT 0–IIIの4つのサブ複合体によって推し進められます。
ESCRT 0はHRSとSTAMのヘテロダイマーで
初期エンドソームへ標的化されます。
それはHRSの
PtdIns3P-binding FYVeドメインによって起こります。
--
ESCRT-IからESCRT-IIIへの系統的な活性は
エンドソーム膜の陥入、内側の発芽を仲介します。
従って、エクソソームの前駆体である
腔内膜小胞の形成に関わっています。
腔内膜小胞の量が増えると
エンドソームは後期課程の多胞体へと成熟します。
これにはRAB5, RAB7が関与します。
このRAB7-GTPのエフェクターが
後期エンドソームの特性に影響を与えます。
また
〇VPS34 complex II
〇Retromer complex
これらを含みます。
これはエンドソームの運命を決める
PtdIns3Pの形成を行います。
後期課程のエンドソームのPtdIns3Pは
PtdIns3P 5-kinaseのための基盤として働きます。
これはエンドソーム、リソソーム機能や
その恒常性において重要です。
//まとめ//ーー
エンドソームが初期過程で細胞質に戻されるか。
後期課程の多胞体に成熟するか、
あるいはリソソームに分解されるかは
エンドソーム膜のリン脂質である
ホスフォイノシチドの型によって決まります。
エンドソームはPtdIns3Pに偏って膜形成されますが、
それがPtdIns4Pに変わると細胞質に変わります。
またPtdIns3Pが強固に残ると
エンドソームはそのまま存在し続け
後期課程に成熟するか
リソソームによる分解されます。
//考察、疑問//ーー
エクソソームの前駆体である腔内膜小胞は
後期課程のエンドソームに陥入することで生じます。
その時の膜の融合の際に
ホスフォイノシチドの変換は必要なのか？
必要でなければ、
腔内膜小胞の膜のリン脂質はPtdIns3Pが
主要であると言えます。
また、それがエクソサイトーシスする際には
またエンドソームは細胞膜と融合する必要があるため
ホスフォイノシチドの変換が必要ですが、
その際に内腔にある腔内膜小胞の膜のリン脂質は
影響をうけないのか？
つまり、最終的に細胞外に放出された
エクソソームのリン脂質のホスフォイノシチドの型の
構成は典型的にはどのようなのか？
そのような疑問が残ります。
(参考文献)
(1)
York Posor, Wonyul Jang & Volker Haucke
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(2)
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STINGアゴニスト-PEG脂質ナノディスク複合体による固形癌免疫治療
//背景//ーー
ある程度の大きさな成長した腫瘍組織を
免疫機能によって退行させようとした場合には、
通常の免疫監視よりも顕著に鋭い
免疫原性が必要になります。
自然免疫系、獲得免疫系が連携して働く必要がありますが、
治療による助けが必要です。
その自然免疫系の癌特異的な免疫原性を
生み出すためにはいくつかの信号があります。
〇Toll様受容体
〇RIG-Ⅰ様受容体
〇NOD様受容体
〇STING経路
これらです(3,18)。
その中で癌細胞のSTNIG経路を細胞外部、内部の
経路を使って治療することは
癌免疫療法において有望であると考えられてます(4,5)。
しかし、
STINGを標的としたアゴニストによる活性化による
癌特異的な免疫原性を得る事は難しさがあると言われています。
その理由はその活性を高めるアゴニストである
環状ジヌクレオチド(CDNs)は
親水性、低分子量であり、
組織浸透性が低く、
酵素によって分解されやすい特徴があります。
従って、静脈注射や経口投与など
全身性の投与方法では適さない物質である
と考えられています(3)。
新しいSTINGアゴニストも有毒性の問題があります(6-8)。
--
リポソームによって
STINGアゴニストを輸送する方式もありますが、
CDNは2～10%程度の少量しか
癌細胞や腫瘍浸潤免疫細胞に届かなかった
とされています(9,10)。
その理由としては
細胞外マトリックスが癌組織回りでは
密に張り巡らされていることと
細網内皮システムによる除去が挙げられています(1)。
ナノ粒子の腫瘍組織浸潤のためには
〇大きさ
〇形
〇電荷
〇表面化学
〇堅牢性
など多くのパラメータが影響を与えます(11,12)。
最近の研究では
〇100nm以下
〇高いアスペクト比
これらが適していると報告されています(12-17)。
上述した背景から
Eric L. Dane, Alexis Belessiotis-Richards(敬称略)
らからなる医療研究グループは
〇PEGylated脂質
〇高融点リン脂質
から成るナノディスクにへき開可能な結合によって
STINGアゴニスト環状ジヌクレオチドを
形成されています(1)。
形は高アスペクト比のナノディスクで
短辺は15nm～45nmです。
これ自身は癌細胞を死滅させる能力はありませんが、
STING経路依存的に免疫機能が高まり
腫瘍組織の退行がマウスのケースで確認されました。
比較対象のリポソームよりも顕著に優れています(1)。
その内容の一部、追記、考察について
読者の方と情報共有したいと思います。
//膜浸透性//ーー
(*)参考文献(1) Fig.2参照
脂質ナノディスクは
被膜の細孔サイズが200nmでは
シミュレーション結果によると
ほぼ100nmの浸透率があります。
一方、100nm程度のリポソームでは
浸透率が10%程度でした。
細孔サイズが50nmになると
リポソームはほぼ0%で
脂質ナノディスクは50%以上ありました、
つまり、
ある程度力がかかると
浸透性に関しては薄いほうが反映される
ということです。
脂質材料の弾性が関係していると考えます。
従って、癌細胞周りに張り巡らされている
密にある細胞外マトリックスを超えて
癌組織まで到達する確率が上がると考えられます。
このような高アスペクト比の設計は
細胞種特異的輸送系統のナノ粒子でも採用できます。
一方で、細胞外小胞の場合は
このような操作はできないことから
この点に関して脂質ナノ粒子の利点が見いだせます。
一方向を大きくできるということは
製造の面で有利であると言えます。
//生体内分布//ーー
ナノディスクの癌組織輸送向性は
リポソームのおおよそ8倍程度であることが分かります。
他の臓器では
肝臓、脾臓、血中が高く
リポソームでは脾臓が顕著に高くなっています。
(参考文献(1) fig.3b)
また、Fig.3dから
ナノディスクは腫瘍組織の内部に均一に
分布していることがわかります。
しかし、
リポソームは最外周部分だけに分布しています。
この事からナノディスクの浸潤性の高さが
確認できます。
//癌の経時変化//ーー
マウスへの癌の接種から
成長は指数関数的でリポソームでも当てはまります。
しかし、ナノディスクでは
一旦退行が見られ、やや上昇がみられるものの
腫瘍組織の量としては低水準に収まっています。
(参考文献(1) Fig.4c)
//免疫機能//ーー
特にリポソームと比べて
ナノディスクでは
IFN-βが高く、IL-6, TNF-αも高まっています。
(参考文献(1) Fig.5b)
またSTINGアゴニスト陽性の
樹状細胞も高まっています。
これは自然免疫系なので応答は早く
治療から1日で急激に上昇しています。
(参考文献(1) Fig.6f)
獲得免疫系のCD8＋T細胞も高まっています。
(参考文献(1) Extended Data Fig. 9a）
//疑問//ーー
PEGを使った脂質ナノ粒子は新型コロナウィルスの
mRNAワクチンで利用されています。
その中で許容的な副反応で収まっています。
一部、アレルギー反応はありますが、
ケースとしては稀です。
しかし、今回は形状がディスク状で大きく違う事と
STINGアゴニストが入っているので
それによる免疫系の副作用がどうか？
という点が疑問です。
//考察1//ーー
今回、一つの興味深い結果は
PEG複合ナノディスクにSTINGアゴニストを結合させた
Eric L. Dane, Alexis Belessiotis-Richards(敬称略)
ら医療研究グループのナノ粒子デザインでの生体内分布です。
血液が多くなっています。
これは血液中の免疫細胞のSTING経路を活性化させたのか？
上述した副作用も含めて
それによる全身の影響はどうか？
この点に関心があります。
Fig.3を見ると肝臓と尾の部分と腫瘍組織部に
局在化しているので
肝臓、血中での取り込みを減らすことができたら
さらに薬剤輸送効率は高まると考えられます。
//考察2//ーー
Eric L. Dane, Alexis Belessiotis-Richards(敬称略)らが
Fig.1b示すナノディスクのデザインでは
PEG-5000脂質が
STINGアゴニストCDNを結合しているPEGよりも長く
それによってCDNが窪みに形成されるデザインとなります。
これによって分解しやすいCDNが守られている
構造になっていると考えられます。
このような構想は
細胞種特異的輸送系統(*)でも利用できます。
(*)Cell-type-specific delivery system
標的細胞特異的な表面リガンドを
低分子量のPEGに結合させ
高分子量のPEGを周囲に形成することで
輸送経路での劣化を防ぐことができます。
//考察3//ーー
Rebecca C. Larson, Michael C. Kann(敬称略)ら
医療研究グループは
CAR-T細胞療法が血液性の腫瘍には有効で
固形の癌には効果を発揮しにくいことは
単に輸送の問題ではない事を示されています(2)。
IFNγR信号経路の遺伝子を欠損させた状態では
よりCAR-T細胞の腫瘍細胞への効果が弱まり、
これは血液性の癌では確認されなかったとあります(2)。
STING経路はIFNγ信号と関連するので
STINGアゴニストなどによる免疫原性を向上させる方法は
固形癌の免疫療法の場合では
CAR-T療法に限らず
ナノ粒子を使った癌免疫療法
それ以外の癌免疫療法でも
必要条件である可能性があります。
免疫チェックポイント阻害薬と融合させる形での
治療も考えられます。
考えられる理由としては
血液中では癌細胞はある程度のクラスターはあっても
バラバラに存在します。
しかし、固形癌は塊の組織になっています。
このような細胞の集中性が関係しているのではないか
と考えられます。
より狭い範囲に癌細胞が濃縮された固形の癌組織の場合には
より集中的な治療が退行のために必要であるため
免疫的に治療する場合には
局所的に強い癌特異的免疫原性を生み出す必要がある
と考えます。
(参考文献)
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細胞膜は脂質、リン脂質から構成されます。
それらは混在し、リン脂質は
全体のおおよそ45%の体積を占めるといわれています。
細胞膜のリン脂質はホスフォイノシチドから
構成され、細胞内で1%しかないので
ほぼ細胞膜排他的に形成していると言えると考えます。
このホスフォイノシチドは酵素によって
代謝サイクルを持っていて、
サブタイプを変換する事によって
細胞膜の変形や小胞の移動に関わっているとされます。
York Posor, Wonyul Jang & Volker Haucke
(敬称略)ら医療研究グループは
細胞の物質の取り込み、その小胞形成に関わる
エンドサイトーシスについて
クラスリン依存、非依存的なプロセスを
総括されています(1)。
その内容の一部、追記、考察を
読者の方と情報共有したいと思います。
//エンドサイトーシス//ーー
ホスフォイノシチドである
PtdIns4PとともにPtdIns(4,5)P2は
細胞膜の強い陰イオン特性に影響を与えます。
PtdIns4Pは
〇PI4KIIIα
〇関連サブユニットEFR3, TTC7
これらによって合成されます(2)。
この複合体はFAM126Aによって安定化されます。
このタンパク質は脳の低髄鞘形成の患者さんで
変異していることがわかっています(3)。
PtdIns4PはPtdIns4P 5-kinases(PIPKI)。
これによってPtdIns(4,5)P2に変換されます。
これはエンドサイトーシス小胞形成に必要な脂質です。
一方、
エンドソームシステムは3-ホスフォイノシチドが
主要に形成しています。
エンドサイトーシスで見られる共通性は
その被膜がPtdIns(4,5)P2からPtdIns3Pに
変換されることに関係しています。
--
つまり細胞膜、エンドサイトーシス、エンドソーム形成
の過程においてホスフォイノシチドは
酵素の働きによってその特性に応じて
変換されていると言えます。
//クラスリン仲介エンドサイトーシス//ーー
クラスリン仲介エンドサイトーシス
Clathrin-mediated endocytosis (以下CME)は
全ての細胞が構造的に物質を内包化する
共通的な経路です(4)。
CMEの間、クラスリンは
表面リガンドである積荷タンパク質を
クラスリン被覆ピットに集中させます。
これは積荷タンパク質とPtdIns(4,5)P2。
これら両方をクラスリンアダプターが
同時検知することを通して行われます(5)。
--
発生期のクラスリン被覆ピットは
細胞膜を変曲させる機能を獲得し、
やがて発芽、エンドサイトーシス小胞を形成します。
分裂を通じて初期のエンドソームとなります。
このプロセスの間
PtdIns(4,5)P2は徐々に
3'-ホスフォイノシチドに変換されます。
それはエンドソーム系を特徴づけます。
--
多くのエンドサイトーシスタンパク質は
PtdIns(4,5)P2を関連し
〇the early-acting clathrin adaptor AP2,
〇the Bin–Amphiphysin–Rvs (BAR) domain-containing
proteins Fer/Cip4 homology domain-only protein 1
(FCHO1) and FCHO2
〇numerous cargo adaptors
これらを含みます(6)。
上述した
PtdIns(4,5)P2とFCHOタンパク質は
AP2の配座オープンニングを誘発し、
積荷タンパク質とクラスリンに結合することができます(7-9)。
発生期のクラスリン被覆ピット形成と
PtdIns(4,5)P2の合成は
AP2カーゴ複合体であるPIPKⅠの活性化に関わります(10)。
これはクラスリン被覆ピットの核形成の間
PtdIns(4,5)P2の局所的形成を誘発するため
PtdIns(4,5)P2に結合するアダプターの
正方向ループを立証します。
これはAP2に結合するクラスリンが
PIPKⅠを離脱させるまで続きます(11)。
--
クラスリン被覆ピットの成長と成熟は
PtdIns(4,5)P2が徐々に減少し、
PtdIns(3,4)P2が合成される事で生じます(12)。
このホスフォイノシチド変換のメカニズムは
〇PtdIns(4,5)P2 5-phosphatase synaptojanin 1 p170(13) ,
〇PtdIns(3,4,5)P3
〇PtdIns(4,5)P2 5-phosphatase SHIP2(14)
これらの引き付けが関与します。
同時に
クラスリンは
PtdIns4PからPtdIns(3,4)P2を合成するために
PtdIns(4,5)P2-activated class II PI3K PI3KC2α。
これを引き付けます(12,15,16)。
このPI3KC2α、PtdIns(3,4)P2。
これらいずれかの欠損はクラスリン被覆ピットの
動きを停止させ、陥入過程に障害を与えます(12,16)。
PIK3C2A遺伝子のホモ接合変異は
腎臓疾患や白内障のような
先天性の疾患と関連があります。
これは細胞の早期老化を引き起こします(17)。
--
PtdIns(3,4)P2はエンドサイトーシスに関わる
クラスリン被覆ピットの収縮を促進するために
〇Membrane curvature-inducing Phox homology (Px)
domain–BAR domain-containing proteins sorting nexin 9
(SNX9) and SNX18 (12,18,19)
〇アクチン重合化を刺激(20)
これらを利用します。
この被膜の収縮は
エンドサイトーシス小胞の分裂、独立化のための
必要条件です。
それは集合的な
large GTPase dynamin
これを通して行われます(21)。
それは
PtdIns(4,5)P2にプールされた
pleckstrin homology (PH) domain
これによって仲介されます(22,23)。
--
OCRL/synaptojanin 1仲介の加水分解は
PtdIns4Pを生成します(24)。
それは、クラスリンコートを除去するために
最終的に
〇co-chaperone protein auxilin
〇GAK
これらを引き付けます。
PtdIns(3,4)P2からPtdIns3Pの変換は
エンドソーム
4-phosphatase INPP4A。
これによって生じます(16,25)。
これは初期エンドソームに
発生期のエンドサイトーシス小胞が融合することを
促進するかもしれないと考えられています。
//クラスリン非依存性エンドサイトーシス//ーー
クラスリン非依存のエンドサイトーシスは
周辺環境などのコンテクスト依存や
組織特異的な需要に反応します。
それは受容体仲介クラスPI3K活性と関係します。
--
エンドフィリン仲介エンドサイトーシス(FEME)。
この間に、信号受容体の活性化は
受容体関連
class I PI3K isoforms PI3Kα and PI3Kβ。
これらによるPtdIns(3,4,5)P3合成を誘発します。
--
5-phosphatases SHIP1, SHIP2。
これらによるPtdIns(3,4)P2の形成は
PtdIns(3,4)P2関連アクチン変調器Lamellipodin。
これの細胞膜結合を誘発します(26)。
このLamellipodinは
被膜を変形させるN-BAR domainを含むタンパク質である
エンドフィンを細胞のエッジに引き付けます。
そこから受容体をエンドソーム内に内包化します。
加えて
この内包化プロセスは
F-BARドメインを含むタンパク質
FBP17とCIP4に依存します。
これはエンドフィリン構築、アクチン、ダイナミン。
これらのプロセスを準備します。
--
多量の細胞外の液体はマクロピノサイトーシスによって
内包化、細胞内に取り込まれます。
そのためには細胞膜を大きなスケールで変形させる
必要があります。
それはアクチンの重合化が関与します。
PIPKIαとPIPKIγ。
これらにより生産されたPtdIns(4,5)P2は
〇アクチンネットワークの安定化。
〇アクチン核形成促進因子の活性化。
これらにおいて重要な役割を果たします(27)。
--
マクロピノサイトーシスカップの伸長、閉鎖は
PtdIns(3,4,5)P3のクラスⅠ PI3K仲介合成によって生じます。
これは
グアニン-ヌクレオチド交換因子。
GTPase活性タンパク質。
これらの改変を通したRho family GTPases。
この活性によって仲介されます(28,29)。
この過程では
PtdIns(4,5)P2の喪失
アクチンメッシュワークの分解が
マクロピノサイトーシスカップの基底から生じます。
それに引き続いて
SHIP1/2 and INPP4A/B。
これらの活性がPtdIns(3,4,5)P3をPtdIns3Pに
変換し、MTMR6を除去します(30,31)。
--
PtdIns3P and PtdIns4P結合タンパク質Phafin 2。
これはホスフォイノシチド変換と
アクチン細胞骨格の配置調整を結びつけます。
それによりマクロピノサイトーシスによる
内包化が可能になります(32)。
//まとめ//ーー
エンドサイトーシスの共通的な原理は
被膜の変形、形状制御をホスフォイノシチド変換反応と
結びつけることにあります。
ホスフォイノシチド変換では
PtdIns(4,5)P2からPtdIns3Pに移り変わります。
従って、初期のエンドソームでは
PtdIns3Pが細胞膜リン脂質の構成で多くなります。
(参考文献(1) Fig.2参照)
//細胞種特異的輸送系統の観点//ーー
細胞種特異的輸送系統(*)において
エクソソームなど細胞外小胞を輸送媒体として使う時には
細胞外小胞に任意の表面リガンドを形成する事が
1つの有効な手段であると想定されます。
(*)Cell-type-specific delivery system
その具体的な方法としては
親細胞に遺伝子ベクトルを入れて、
その遺伝子のタンパク質発現によって
細胞外小胞表面に任意の表面リガンドを形成させます。
その時には細胞外小胞に比べて
顕著に大きな面積を占める細胞膜から
表面リガンドを引き継ぐ必要がありますが、
どのように選択されるかはランダムではない可能性があります。
例えば、エクソソームで有れば
テトラスパニンと呼ばれる表面リガンドが
代表的なものとして挙げられます。
York Posor, Wonyul Jang & Volker Haucke
(敬称略)らが示す参考文献(1) Fig.2aでは
表面リガンドの細胞質側に
クラスリンアダプターが結合する様子が描かれています。
このクラスリンアダプターが結合する
表面リガンドは少なくとも
エンドソーム形成には必要で、
少なくもエンドソーム内側には形成されることになります。
このような陥入プロセスに関わる表面リガンドが
少なくともリン脂質の部分の中では
優先的に引き継がれると考える事もできます。
その時に膜を変形するために
どれくらいの密度が必要かというのが重要な視点です。
膜を変曲させるため
クラスリン被覆ピットに集合させる必要があるので、
表面リガンドが高密度で形成することも考えられます。
そのような視点に立つと
細胞膜にある表面リガンドの構成と
エンドソーム、腔内膜小胞(エクソソーム)。
これらの表面リガンドの平均的な構成は
変わる可能性があると考えられます。
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