エクソソームに封入された薬剤の効果

エクソソームは離れた細胞間のコミュニケーションの
伝達役として、身体のあらゆる(?)細胞に備わった
内胞システムです。
従って、同じように胞を持つナノ粒子を使って
輸送する場合に、エクソソームを含む細胞外輸送媒体を
使う事は極めて合理的であると言えます。
エクソソームの内外にはドナー細胞の情報が
多く詰まっています。
中にタンパク質や核酸、脂質などが含まれています。
これを狙いの薬理を生むようにエンジニアリングする事で
身体の自然な機序を使って、治療することが
可能になるかもしれません。
--
Xin Luan, Kanokwan Sansanaphongpricha, Ila Myers, Hongwei Chen, Hebao Yuan & Duxin Sun
(敬称略)からなる医療研究グループは
エクソソームに様々な薬理を持つ物質を輸送する事を
想定して、それに関する情報を総括されています。
その内容の一部と追記を読者の方と情報共有したいと思います。

//低分子量分子の輸送//ーー
受動的、能動的な方法でエクソソームの中に
様々な低分子量の薬剤を封入する事ができます。
その分子は親水性、疎水性、両方の場合は想定されます。
ほとんどのケースで
エクソソームによる輸送は
〇標的細胞での高い薬剤蓄積(標的性向上)
〇薬剤分子の安定性向上
〇血液循環時間の向上
〇低いIC-50(輸送、取り込み効率向上)
これらが挙げられています。
<研究①>
牛乳由来のエクソソームの中に抗がん剤を
受動的方法によって封入。
封入された抗がん剤。
〇Paclitaxel
〇Doxorubicin
〇Withaferin
これらです(2)。
これらの抗がん剤はエクソソームからゆっくりと
放出されています。
Paclitaxel、Withaferin封入エクソソームでは
A549肺癌細胞に対する抗増殖活性において
露出されたそのままの状態よりも
低いIC-50値でありました。
これは異種移植マウスのモデル、生体内で確認されています。
特にWithaferin封入エクソソームが効果がありました(2)。
<研究②>
EL-4マウスリンパ腫細胞から取り出したエクソソームに
クルクミンを封入しました。
それによると試験管内で高いクルクミン安定性。
生体内で高い血中濃度がありました(3)。
クルクミンレベルはCD11b+Gr-1+標的細胞で増えました。
また、IL-6やTNF-αなど炎症性サイトカインも
免疫応答性マウスで顕著に低減しています(3)。
つまり、拒絶反応が起こりにくい薬剤輸送システムである
という事も考えられます。
--
<考察>
研究②から血液性のエクソソームは
血中での寿命が長く、とどまりやすい事を示しています。
こういった一致性は他の臓器や組織でも同様かもしれません。
例えば、心筋細胞からのエクソソームは
心筋近くに蓄積しやすいという事がある可能性があります。
iPS細胞で脳神経など取得が難しい細胞も含めて
様々な細胞に分化させることができたら
任意の細胞からエクソソームを生み出すことができます。
そうすれば、
エクソソームを使った細胞種特異的輸送系統(*)の
可能性が広がります。
(*)Cell-type-specific delivery system。
--
<研究③>
マクロファージ由来のエクソソームにPaclitaxel封入しました。
3LL-M227ネズミ科のLewis肺癌細胞において
脂質ナノ粒子に同じPaclitaxelを封入した場合に比べて
顕著に細胞内への取り込みが増えた事が示されています(4)。
Paclitaxel封入エクソソームは
MDCK MDR1細胞で薬剤抵抗性の問題を克服したことが
確認されています。
エクソソームはP糖たんぱく質薬物流出システムを
逃れる事ができるとされていますが、
エクソソームそのものがP糖たんぱく質を
阻害するわけではなく、
薬剤抵抗性をなぜ防いだのかはわかっていません(1)。
またマクロファージ由来のエクソソームに封入する事で
そのままのPaclitaxelよりも
顕著なIC-50値の減少が確認されています(4)。

//治癒性RNAの輸送//ーー
RNAは大きな分子なので生体内で輸送するのは難しい
とされています
そのため
〇陽イオン性リポソーム(5,6)
〇デンドリマー(7)
〇陽イオン性ポリマー(8)
これらのナノ粒子使用の検討がされてきました。
しかしながら、これらの輸送媒体は
臨床で使用するには
〇安定性
〇安全性
〇オフターゲット問題
これらなどいくつか超えないといけない壁があります(9)。
一方、
siRNAやmiRNAをエクソソームの中に封入する
最も共通的な方法は電子穿孔法です。
この方法はエクソソーム膜に穴をあける
能動的封入法であり、大きな分子を封入するのに
適しているからです。
しかしながら、電気穿孔法の電流印加の間
エクソソームやRNAが凝集してしまう問題があります。
<研究①>
マウス樹状細胞由来のエクソソームによって
Lamp2bタンパク質(リソソーム関連タンパク質)を標的にし
GADPH siRNAとBACE1 siRNAを
血液脳関門を超えて輸送しました。
それにより静脈注射の後、ワイルドタイプのマウスの脳において
mRNA発現とβアミロイドタンパク質が強く減少しました。
Lipofectamine(遺伝子導入試薬)
siRNA-RVG-9R(siRNA神経細胞伝達)
これらよりも減少しています(10)。
<研究②>
人の血漿から取り出したエクソソーム内にsiRNAを導入。
単球とリンパ球を標的にすることが可能になりました。
それによりMAPK1遺伝子の働きを抑制することに成功しています。
siRNA積載エクソソームは受け細胞の細胞質に蓄積しています。
生体内での環境では試験管よりもエクソソームの取り込みが
難しくなります(11)。
<研究③>
GE-11標的エクソソームにlet-7a miRNAを封入し
EGFRが過剰発現した乳癌細胞に輸送しました。
マウスの異種移植モデルです。
それによりコントロール条件よりも
エクソソームの高い腫瘍蓄積が見られました。
以前にlet-7a miRNAを遺伝子導入された
ドナー細胞から取り出したエクソソームは
マウスのモデルで腫瘍の成長を抑制しました(12)。
エクソソームは遺伝子輸送をより安全に行うことができます。
ウィルス、陽イオン脂質、ポリマーから成る
ナノ粒子よりも安全である可能性があります。

//治癒性タンパク質の輸送//ーー
エクソソームはマクロ分子タンパク質を輸送する
有望な方法の一つです。
タンパク質はドナー細胞の遺伝子エンジニアリングを
通して封入することもできます。
あるいはエクソソームに直接積載することもできます。
ドナー細胞にプラスミドを持つ遺伝子が導入されます。
細胞はその遺伝子によって生み出された
タンパク質を細胞質に含み
それがエクソソームの中に取り込まれます。
その後、取り出されたエクソソームを精製します。
-
カタラーゼ、レドックス酵素を積載した
マクロファージ由来のエクソソームは
急性脳炎症を持つマウスの酸化ストレスに対する
神経保護機能がありました。
カタラーゼ積載エクソソームは
マイクログリオーシスとアストロサイトーシス
を顕著に減少させました。
これらは共に脳の病原性の作用です。
これらは経鼻投与の後確認されました(13)。

//イメージング分子の輸送//ーー
イメージングの為、エクソソームの表面構造を修正する
手法が開発されています。
<研究①>
人、胚の腎臓293Tエクソソームは
Gaussian luciferase(発光酵素)を発現しています。
それをビオチン受容体ドメインと融合させます。
これによって蛍光発光するエクソソームを
生体内で追跡することができます(14)。
<研究②>
エクソソームタンパク質CD24, AQP2に
蛍光色素分子を複合体化させた抗体を使っています。
それによってCD24, AQP2を持つエクソソームを
試験管内で追跡する事ができます(15)。
<研究③>
内皮細胞由来のエクソソームに
抗CD63抗体-マイクロビーズ複合体
Q-dots(量子ドット)-抗体複合体
これらを組み込みナノ粒子追跡分析を行っています(16)。

//まとめ//ーー
エクソソームは後期のエンドソームの発芽によって
形成され、多胞体(MVBs)となり、
その後、細胞外に放出されます。
従って、エンドソームに含まれるたんぱく質
〇Sortingタンパク質(Rab5, Rab27 and Rab35)
〇ヒートショックタンパク質
〇テトラスパニン(CD9, CD63 and CD81) 
これらをエクソソームが含むことは自然な流れです。
従って、どのエクソソームを選ぶかは
治療を行う上で重要です。
これらの情報はエクソソームの内腔だけではなく
膜や表面リガンドでも当てはまると考えられます。

(参考文献)
(1)
Xin Luan, Kanokwan Sansanaphongpricha, Ila Myers, Hongwei Chen, Hebao Yuan & Duxin Sun 
Engineering exosomes as refined biological nanoplatforms for drug delivery
Acta Pharmacologica Sinica volume 38, pages754–763 (2017)
(2)
Munagala R, Aqil F, Jeyabalan J, Gupta RC.  Bovine milk-derived exo-
somes for drug delivery.  Cancer Lett 2016; 371: 48–61.
(3)
Sun D, Zhuang XY, Xiang X, Liu Y, Zhang S, Liu C, et al.  A novel 
nanoparticle drug delivery system: the anti-inflammatory activity of 
curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes.  Mol Ther 
2010; 18: 1606–14.
(4)
Kim MS, Haney MJ, Zhao Y, Mahajan V, Deygen I, Klyachko NL, et al.  
Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome mdr in 
cancer cells.  Nanomedicine 2016; 12: 655–64.
(5)
Yano J, Hirabayashi K, Nakagawa S, Yamaguchi T, Nogawa M, 
Kashimori I, et al.  Antitumor activity of small interfering RNA/cationic 
lipo some complex in mouse models of cancer.  Clin Cancer Res 2004; 
10: 7721–6.
(6)
Sioud M, Sorensen DR.  Cationic liposome-mediated delivery of 
siRNAs in adult mice.  Biochem Biophys Res Commun 2003; 312: 
1220–5.
(7)
Patil ML, Zhang M, Taratula O, Garbuzenko OB, He H, Minko T.  
Internally cationic polyamidoamine PAMAM-OH dendrimers for siRNA 
delivery: effect of the degree of quaternization and cancer targeting.  
Biomacromolecules 2009; 10: 258–66.
(8)
Thomas  M,  Lu  JJ,  Ge  Q,  Zhang  C,  Chen  J,  Klibanov  AM.    Full 
deacylation of polyethylenimine dramatically boosts its gene delivery 
efficiency and specificity to mouse lung.  Proc Natl Acad Sci U S A 
2005; 102: 5679–84.
(9)
Kesharwani P, Gajbhiye V, Jain NK.  A review of nanocarriers for the 
delivery of small interfering RNA.  Biomaterials 2012; 33: 713–50.
(10)
Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H, Betts C, Lakhal S, Wood MJ.  Delivery of 
siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes.  
Nat Biotechnol 2011; 29: 341–5.
(11)
Wahlgren J, Karlson TD, Brisslert M, Sani FV, Telemo E, Sunnerhagen P, 
et al.  Plasma exosomes can deliver exogenous short interfering RNA 
to monocytes and lymphocytes.  Nucleic Acids Res 2012; 40: e130.
(12)
Ohno S, Takanashi M, Sudo K, Ueda S, Ishikawa A, Matsuyama N, et 
al.  Systemically injected exosomes targeted to EGFR deliver antitumor 
microRNA to breast cancer cells.  Mol Ther 2013; 21: 185–91.
(13)
Haney MJ, Klyachko NL, Zhaoa YL, Gupta R, Plotnikova EG, He ZJ, 
et al.  Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease 
therapy.  J Control Release 2015; 207: 18–30.
(14)
Lai CP, Mardini O, Ericsson M, Prabhakar S, Maguire CA, Chen JW, et 
al.  Dynamic biodistribution of extracellular vesicles in vivo using a 
multimodal imaging reporter.  ACS Nano 2014; 8: 483–94.
(15)
Oosthuyzen W, Sime NE, Ivy JR, Turtle EJ, Street JM, Pound J, et al.  
Quantification of human urinary exosomes by nanoparticle tracking 
analysis.  J Physiol 2013; 591: 5833–42.
(16)
Wang J, Guo R, Yang Y, Jacobs B, Chen S, Iwuchukwu I, et al.  The 
novel methods for analysis of exosomes released from endothelial 
cells and endothelial progenitor cells.  Stem Cells Int 2016; 2016: 
2639728.