ナノ粒子による核酸の輸送(9)-生物学的分析-

例えば、細胞核内の特定の遺伝子を改変し、
遺伝子治療を行うためには
オフターゲットが無いように
特定の細胞に輸送し、細胞質を通って
核内の特定の遺伝子に作用させる必要があります。
標的となる重要な遺伝子が明らかになり、
その遺伝子を編集したり、
活性を変える事ができれば、
1つ、根本的な治療になりますが、
それを阻んでいるのが細胞特異的な標的性が
困難であるからであると理解しています。

例えば、癌など様々な疾患で
全ゲノム関連遺伝子評価が行われています。
それによって、場合によれば、数百個以上の
遺伝子異常が確認されることがありますが、
病気において重要な複数の遺伝子を見つける事も出来ます。
このような解析を有効にするためには
1つの大きな柱となるのが遺伝子治療です。
重要な遺伝子異常を標的として、
その遺伝子を改変する事ができれば、
病状が改善する可能性があります。
しかし、上述したように
その組織に有効に、特異的に核酸を輸送し、
さらには無数の膜を超えて細胞核まで届けるには
いくつかの大きなハードルがあります。
また、全ゲノム関連遺伝子評価から
標的とする遺伝子(群)を絞り込むところにも
まだ課題がある可能性があります。
個人差が大きければ、それも阻害要因となります。

そのような標的性以外にも
導入するナノ粒子が
例えば免疫的な拒絶反応が起こらないような
生体内で安全なものが強く求められています。
上述した免疫系は異物に対する高い除去能力を持っています。
通常、静脈注射などによる循環器を通した輸送では
血中に多種多様な免疫細胞が存在しているので
その複雑な監視を逃れる必要があります。
そのため特にナノ粒子の生体に対する互換性や
ナノ粒子表面の特性が重要になります。

RNAやDNAなどの核酸の輸送における
ナノ材料、ナノ粒子は上述した課題がありますが、
それらを満たす潜在性を有しています。
また、ナノ粒子を使う事によって
特定の遺伝子をオフ/オンにする遺伝子治療だけではなく
〇生物的な分析
〇タンパク質の補充、生成
〇ワクチン
これらにも応用することができます。
例えば、生物学的分析では
マーカー遺伝子、遺伝子のバーコード化によって、
ナノ粒子が標的細胞に届いたかどうか？
といった検査にも使うことができます。
また、遺伝子はタンパク質を生み出す元となる物質なので
タンパク質の分析、補充、生成を
人為的に行うことができます。
ワクチンにおいて
実際に新型コロナウィルスで使われた
mRNAワクチンは上述したナノ粒子によって
自然免疫系細胞まで輸送されていると考えられています。
このワクチンは樹状細胞などで
大量の新型コロナウィルスのSタンパク質を生み出し、そ
れを抗原とした免疫反応を
利用していると考えられています。
従って、ナノ粒子、mRNA(核酸)の技術は
現在ワクチンでは広く普及しています。
ーー
Bárbara B. Mendes, João Conniot, Aviram Avital, Dongbao Yao, Xingya Jiang, Xiang Zhou, Noga Sharf-Pauker, Yuling Xiao, Omer Adir. 
(敬称略)ら医療研究グループは
効果的な核酸の輸送デザインの方法と
それによる診断や治療の効果について総括されています(1)。
その内容のうち生物学的な分析の内容の一部を
読者の方と情報共有したいと思います。

//試験管での分析//ーー
細胞の研究に移る前に、
生体内でナノ粒子の膜などの界面の状態を理解するため
ウシ胎仔血清などの生体液での
ナノ粒子の安定性などを調べます(2,3)。
ナノ粒子はリガンドなどを考慮すると
界面は平たんではないため大きな表面積を持ちます。
それゆえに、生体液と複雑な相互作用が生じます。
それが細胞内の有毒な標的に対する反応性に影響を与えます。
--
試験管による分析では、局所的な微小環境の
生物学的、物理的な特徴を再現する事に制限はあります。
従って、適切な細胞モデルを選ぶ必要があります。
例えば、以下の項目に従って選ぶ必要があります。
〇ナノ粒子のタイプ、構成
〇核酸のカテゴリ
〇標的疾患
例えば、
〇免疫細胞
〇患者さん由来の疾患の細胞
〇線維芽細胞
これらの異なる細胞タイプに対して
〇培養条件
〇力学的条件
〇空間的条件
これらを病気に合わせて整えます。
それを実現する具体的な方法はオルガノイド(人工臓器)や
それを基板、チップの上に乗せる(organs-on-chips)
ものです(4-6)。
これらの手法により、より生体内の環境に近づけます。
それによりナノ粒子の薬剤輸送効率や
細胞傷害性などを評価します(7)。
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核酸を積載したナノ粒子が細胞に取り込まれたどうかは
〇透過型電子顕微鏡(TEM)
〇共焦点顕微鏡法(confocal microscopy)
〇フローサイトメトリー
これらによって調べる事ができます(8)。
核酸の輸送効率は標的とした遺伝子の表現のレベル
によって評価する事ができます。
また
〇光学顕微鏡
〇MTTアッセイなどによる細胞生存判別試験
これらによって
細胞の増殖、分布、生存
ナノ粒子投与量依存性を評価します。

//生体内モデルの臨床前評価//ーー
ナノ粒子による薬剤輸送を含むナノ医療に
関わっている医療研究者の方々は
個別化医療の重要性について議論してきました。
そのためには適切な動物実験モデルが必要です。
また性差についても考慮する必要があります(9)。
さらに、
ナノ粒子をどういった投与ルートで輸送するか
これについて詳細に検討する必要があります。
どの生体内ルートを経るかは
〇ナノ粒子中の拡散の薬剤動力学
〇生体内分布
〇全体の治療効率
これらに関わると考えられるからです。
例えば、
金ナノ粒子にsiRNAを複合体化させ
それをヒドロゲルに包ませた構造では
ナノ粒子安定性は高く、
かつ副反応を最小化することができました。
対象となった疾患は大腸癌で
その完全寛解を促しました(8)。
一方、
ナノ粒子のタイプ、形、電荷、大きさは
生体内分布に影響を与えます(3,10,11)。
小さなナノ粒子(10-20nm)は
腎臓で迅速に除去されます(12)。
一方で、
100nm以上のナノ粒子は
単球による食作用によって取り込まれてしまいます。
血中に循環した時に生じるナノ粒子オプソニン化によります。
つまりナノ粒子を異物とみなし、抗体が発現され
抗体は補体が結合する事によって
単球などの免疫細胞の食作用によって除去されやすくなります。
また、脾臓によりフィルター処理され、
肝臓内に隔離されます(13,14)。
従って、ナノ粒子の大きさは20～100nmくらいの間で
設計されることが好ましいかもしません。
加えて
標的サイトにナノ粒子が到達した量を評価する事は
その治療効果を評価する上で最も重要な事です(15)。
従って、
(重量)単位標的組織、臓器当たり
投与量に対してどれくらいの割合のナノ粒子が輸送されたかは
臨床前段階で報告する必要があります。
従って、治療や遺伝子経路に反応した遺伝子プロファイルを
分析する事が推奨されます。
その時には本当に狙いの組織の遺伝子変わったかどうかを示す、
組織特異的、細胞特異的な遺伝子マーキングが
使用させる可能性もあります。

(参考文献)
(1)
Bárbara B. Mendes, João Conniot, Aviram Avital, Dongbao Yao, Xingya Jiang, Xiang Zhou, Noga Sharf-Pauker, Yuling Xiao, Omer Adir, Haojun Liang, Jinjun Shi, Avi Schroeder & João Conde 
Nanodelivery of nucleic acids
Nature Reviews Methods Primers volume 2, Article number: 24 (2022)
(2)
Conte, C. et al. Multi-component bioresponsive 
nanoparticles for synchronous delivery of docetaxel 
and TUBB3 siRNA to lung cancer cells. Nanoscale 13, 
11414–11426 (2021).
(3)
Chen, F. et al. Complement proteins bind to 
nanoparticle protein corona and undergo dynamic 
exchange in vivo. Nat. Nanotechnol. 12, 387–393 
(2017).
(4)
Kim, J., Koo, B.-K. & Knoblich, J. A. Human organoids: 
model systems for human biology and medicine.  
Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 571–584 (2020).
(5)
Skylar-Scott, M. A. et al. Biomanufacturing of 
organ-specific tissues with high cellular density and 
embedded vascular channels. Sci. Adv. 5, eaaw2459 
(2022).
(6)
Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P. 
& Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. 
Nat. Rev. Drug Discov. 20, 345–361 (2021).
(7)
Kohl, Y. et al. Microfluidic in vitro platform for (nano)
safety and (nano)drug efficiency screening. Small 17, 
2006012 (2021).
(8)
Conde, J., Oliva, N., Zhang, Y. & Artzi, N. Local 
triple-combination therapy results in tumour 
regression and prevents recurrence in a colon cancer 
model. Nat. Mater. 15, 1128–1138 (2016).
(9)
Poley, M. et al. Chemotherapeutic nanoparticles 
accumulate in the female reproductive system  
during ovulation affecting fertility and anticancer 
activity. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/ 
2020.07.22.216168 (2020).
(10)
Duan, X. & Li, Y. Physicochemical characteristics  
of nanoparticles affect circulation, biodistribution, 
cellular internalization, and trafficking. Small 9, 
1521–1532 (2013).
(11)
Elci, S. G. et al. Surface charge controls the suborgan 
biodistributions of gold nanoparticles. ACS Nano 10, 
5536–5542 (2016).
(12)
Soo Choi, H. et al. Renal clearance of quantum dots. 
Nat. Biotechnol. 25, 1165–1170 (2007).
(13)
Hoshyar, N., Gray, S., Han, H. & Bao, G. The effect  
of nanoparticle size on in vivo pharmacokinetics and 
cellular interaction. Nanomedicine 11, 673–692 (2016).
(14)
García, K. P. et al. Zwitterionic-coated “stealth” 
nanoparticles for biomedical applications: recent 
advances in countering biomolecular corona formation 
and uptake by the mononuclear phagocyte system. 
Small 10, 2516–2529 (2014).
(15)
Faria, M. et al. Minimum information reporting in  
bio–nano experimental literature. Nat. Nanotechnol. 
13, 777–785 (2018).