エクソソームへの薬剤封入方法

エクソソームに薬剤を効率的に注入する。
そのうえで表面リガンドやナノ粒子の構造を守る。
このような事は
ナノ粒子製剤において必須のことです。
効率的に注入できないと大量生産に耐える工程として
採用することができません。
従って、「Method」を確認し、シェアする事は重要です。
Xin Luan, Kanokwan Sansanaphongpricha, Ila Myers, Hongwei Chen, Hebao Yuan & Duxin Sun
(敬称略)からなる医療研究グループは
エクソソームに対する受動的、能動的な
薬剤封入方法、結合方法について総括されています。
その内容の一部と追記を読者の方と情報共有したいと思います。

<<受動的な薬剤封入方法>>
受動的な方法は比較的シンプルで
系の中に活性な物質を加える必要はありません。

//エクソソームと共に培養//ーー
エクソソームがシンプルに薬剤と共に培養されます。
薬剤は培養液中で濃度勾配に従って
エクソソームの中に封入されていきます。
封入効率は薬剤分子の疎水性の度合いによって決まります。
疎水性の薬剤はエクソソームの膜の脂質層と相互作用します(2)。
1つの研究。
マウスリンパ腫由来のエクソソームは
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の中のクルクミンと共に
培養されました。22℃5分の条件です。
その後、遠心分離機で精製されます(2)。
もう1つの研究。
酵素カタラーゼと4量体タンパク質(250kDa)。
これらをエクソソームに封入する事に成功しました。
エクソソームはRAW264.7細胞由来。
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、室温、18時間。
これらの条件でした(3)。
この方法の欠点は時間の長さから示されるように
積載効率の低さです。

//ドナー細胞と共に培養//ーー
エクソソームを放出するドナー細胞を
薬剤と共に処理します。
1つの研究。
SR4987間葉細胞と共に低用量のパクリタキセルを
処理しました。細胞を洗浄し、
新鮮培地の新しいフラスコで再び、再培養しました(4)。
48時間後、その細胞の馴化培地を集めて
エクソソームを隔離しました。
それによりパクリタキセルが封入された
エクソソームを得る事ができます。
その抗がん剤であるパクリタキセルが封入された
エクソソームは、そうではないエクソソームに比べて
試験管におけるCFPAC-1:ヒト膵臓腺がん細胞。
これにおいて増殖効果を抑制する働きがありました。
しかし、興味深いことに
SR4987間葉細胞から取り出したエクソソームも
ヒト膵臓腺がん細胞に対して一定の
抗増殖効果がありました。
それは癌微小環境を変えるタンパク質や核酸が
エクソソームの中にもともと含まれていたからである
と考えられています(4)。

//考察//ーー
薬剤を細胞内にエンドサイトーシスさせる事によって
自己組織様に薬剤が封入されたエクソソームが放出された
ことが確認されています。
従って、遺伝子などの作用によって
細胞表面に特異的に発現させたタンパク質を含む
改変されたドナー細胞由来のエクソソームを
得るためには、封入させたい薬剤と共に培養することで
狙いの表面タンパク質を含むエクソソームが
得られる可能性があると考えられます。

<<能動的な薬剤封入方法>>

//超音波処理//ーー
ドナー細胞からのエクソソームは
薬剤やタンパク質と共に混合されます。
その後、
ホモジナイザーを使って超音波処理されます。
超音波破砕機からの機械的なせん断応力は
エクソソームの膜の完全性を揺るがせ、
その膜の変形の間にエクソソームの中に
薬剤が封入されます。
実際にエクソソームの微小粘度は
超音波処理の後、顕著に減少していたことが
実験で示されています(5)。
一方で、そのような力は
エクソソームの膜のリガンドや膜の脂質に
大きな影響を与えないことが示されています。
また、
エクソソームの膜の完全性は
エクソソームを37℃で培養した時
1時間以内で元に回復したことが示されています(5)。
しかしながら、いくつかのケースでは
封入したい薬剤はエクソソームの中に入るだけではなく
外側のリガンドや膜と結合して、
外側に複合体を形成することがありました。
故に、製造の上で条件を細かく検討して
外側に形成される薬剤をなくす必要があります。
その様な形成過程は2層構造となっており、
初めは外側に急速に結合し、
その後、内側に取り込まれるとされています(5)。
従って、内側に取り込まれた後、
外側の薬剤を取り除くための何らかの処理が
必要かもしれません。
しかし、その場合、
膜表面のリガンドを残した状態にする必要があります。

//押し出し(Extrusion)//ーー
ドナー細胞からのエクソソームを薬剤と混合し、
その混合材料を注射器ベースの脂質押し出し機に
積載します。その押し出し機は
温度制御下で100nm～400nmの細孔膜を持っています。
押し出しの間、エクソソーム膜は壊れ
活発に薬剤と混合されます。
このようにエクソソームの構造維持において
厳しい環境下、大きな力のもと処理されると
ゼータ電位や膜のリガンドなどが
維持されるかどうかは不明です。
1つの研究。
MDA-MB231:乳癌細胞由来のエクソソームに
ポルフィリンをこの方法で搭載した場合、
ゼータ電位は変わり、細胞傷害性を示しました。
一方で、他の方法でポルフィリンを同様に
搭載したところ細胞傷害性は見せませんでした(6)。
しかし、この報告では31回の押出を集中的に
行ったため、そのような結果になったかもしれません(6)。
もう1つの研究。
RAW264.7マクロファージ由来のエクソソームに
10回の押出によってカタラーゼを積載した場合
細胞傷害性はなく、神経保護的な効果もありました。
この方法では凍結/融解、もしくはシンプルな培養法方法よりも
これらの安全性の効果は高かったとされています(3)。
それゆえに、より詳しい調査が必要であると考えられます。

//電気穿孔法//ーー
電気穿孔法(でんきせんこうほう)とは
電気伝導性のある溶液中で電気パルスをかけ
細胞膜に孔をあけ物質を導入する手法です。
エクソソームに適用された場合
エクソソームのリン脂質2重層で電流が乱されます。
それによって一時的に変形し、穴が形成します。
薬剤もしくは核酸はこの一時的に形成された穴を通過して
エクソソーム内腔に輸送されます。
エクソソームの膜の特性完全性は薬剤が封入された後に回復します。
この方法は、エクソソーム内にsiRNA, miRNAを積載する場合に
広く使われています。
なぜならこれらの拡散は比較的大きく、
自発的にエクソソーム内に拡散する事ができないからです。
一方、小さくて疎水性の分子の場合は
自発的な拡散能力に優れています。
電気穿孔法は化学トランスフェクションを通じて
siRNAの積載に優れています。
しかしながら、
電気穿孔法はRNA凝集やエクソソーム不安定性の原因となり
結果として低い積載容量となってしまいます(7)。
1つの研究。
トレハロース2糖のような最適化された緩衝液中での
電気穿孔法ではエクソソームの構造上の完全性を維持する
ことを助けます。
さらに、脂肪肝細胞から取り出したエクソソームでは
懸念される凝集を防ぐことができました(8)。
--
電気穿孔法はエクソソームのRNA積載を促進するだけではなく
拡散しにくい親水性の小さな分子の積載も促進します。
例えば、
〇5,10,15,20-tetra-kis (1-methyl-4-pyridinio) porphyrin tetra (p-toluenesulfonate)
〇TMP
これらは親水性の小さな分子で光力学作用のため使われます(6)。
光線力学的療法などにも利用できると理解しています。

//被膜浸透促進による培養//ーー
サポニンはサーファクタント(界面活性)分子で
細胞膜表面でコレステロールと複合体を作り、
穴を形成します。それによって被膜浸透を促します(9)。
サポニンはエクソソーム内へのカタラーゼ封入容量を
向上させます。その封入能力は
単純な培養方法よりも優れています。
サポニンは表面活性媒体ですが、
カタラーゼを分解させず、その活性は保持されます(3)。
サポニンは拡散しにくい親水性分子をエクソソーム内へ
輸送させる事を助けます。
実際の研究では11倍の封入効率向上が確認された
という報告もあります(6).
しかし、サポニンは溶血性活性がある事が懸念されます(9)。
従って、サポニンの使用量は制限されます。
またサポニンを使って培養した場合は
生体内に入れるまでにサポニンを抜くために
エクソソームを精製する必要があります。

//直接的複合体形成のためのクリックケミストリー//ーー
化学的方法は共有結合を通して
エクソソームの表面に分子を直接結合させるために用いられます。
胴触媒を用いたアジド-アルキリン付加環化。
これはクリックケミストリーとして知られています。
この結合促進手法は
小さな分子とエクソソーム表面のマクロ分子を
選択的に結合させ、複合体を形成させるのに適しています(10)。
アルキリン化学グループ
アジド化学グループ
これらはトリアゾール結合を形成するために反応します。
この反応は急速で効率的であり、
伝統的なクロス結合反応に比べて優れています。
(マレイミド-チオールカップリング)。
ゆえに複合体結合部位の制御性に優れています。
これは、マクロ分子の生物学的特性の修正に優れています。
なぜなら、水性の媒体中で起こるからです(11)。
実際にカルボジイミドケミストリーを使った
アルキン基にクロスリンクしたエクソソームは
アジド、アジド-フロライト545と複合体を形成しました(12)。
この複合体はエクソソーム内に取り込まれません。
従って、反応は緩やかで
エクソソームの構造や機能に影響を与えるものではありません。

//エクソソームタンパク質に対する抗体//ーー
近年の研究ではエクソソームはドナー細胞の
遺伝子、タンパク質内容物を運ぶことがわかっています。
高い特異性を持った抗体に複合体化された
フルオロフォア、マイクロビーズは
細胞表面の特定の抗原に結合します。
1つの研究。
DiFi細胞からのエクソソームを分析、仕分けするために
この蛍光発光分子を利用した報告があります(13)。
EGFRとエクソソームマーカーCD9。
これらがエクソソーム表面-Alexa-647複合体によって
検出されました。
エクソソームはドナー細胞の抗原を輸送するので、
特異的抗原と複合体化したマイクロビーズが
エクソソーム隔離、生体内追跡のために利用できる
可能性があります。

//まとめ//ーー
エクソソームに薬剤を積載するために様々な方法があり
それぞれ利点と課題があります。
また積荷の親水性、疎水性などの特性によっても
適した方法が異なります。
実際に超音波や押し出しによって積載する方法は
エクソソームに対するカタラーゼの積載において
最も高い封入効率を示したとされています(3)。
それらは受動的な培養や凍結/解凍のプロセスと比べても
優れています。
しかしながら、積載効率は評価項目の一つです。
エクソソーム膜の保護、エクソソームの安定性も
同時に考慮される必要があります。
実際に超音波や押し出しによる能動的な封入方法は
エクソソームの膜特性を変えたり、
表面リガンドの構造を変える事なども懸念されています。
これらはナノ粒子薬剤の特性に大きく影響を与える項目です。
従って、
全体として最適化するためには
封入方法の更なる調査、開発が必要になります。

(参考文献)
(1)
Xin Luan, Kanokwan Sansanaphongpricha, Ila Myers, Hongwei Chen, Hebao Yuan & Duxin Sun 
Engineering exosomes as refined biological nanoplatforms for drug delivery
Acta Pharmacologica Sinica volume 38, pages754–763 (2017)
(2)
Sun D, Zhuang XY, Xiang X, Liu Y, Zhang S, Liu C, et al.  A novel 
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curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes.  Mol Ther 
2010; 18: 1606–14.
(3)
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et al.  Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease 
therapy.  J Control Release 2015; 207: 18–30.
(4)
Pascucci L, Cocce V, Bonomi A, Ami D, Ceccarelli P, Ciusani E, et al.  
Paclitaxel is incorporated by mesenchymal stromal cells and released 
in exosomes that inhibit in vitro tumor growth: A new approach for 
drug delivery.  J Control Release 2014; 192: 262–70.
(5)
Kim MS, Haney MJ, Zhao Y, Mahajan V, Deygen I, Klyachko NL, et al.  
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in cancer cells.  Nanomed-Nanotechnol 2016; 12: 655–64.
(6)
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into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake 
and photodynamic effect of porphyrins.  J Control Release 2015; 205: 
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(7)
Wahlgren J, Karlson TD, Brisslert M, Sani FV, Telemo E, Sunnerhagen P, 
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(8)
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Moos T, et al.  Evaluation of electroporation-induced adverse effects 
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2125–38.
(9)
Podolak I, Galanty A, Sobolewska D.  Saponins as cytotoxic agents: a 
review.  Phytochem Rev 2010; 9: 425–74.
(10)
Hood JL.  Post isolation modification of exosomes for nanomedicine 
applications.  Nanomedicine (Lond) 2016; 11: 1745–56.
(11)
Wang M, Altinoglu S, Takeda YS, Xu QB.  Integrating protein engineer-
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modulation and intracellular delivery.  PLoS One 2015; 10: e0141860.
(12)
Smyth T, Petrova K, Payton NM, Persaud I, Redzic JS, Gruner MW, 
et al.  Surface functionalization of exosomes using click chemistry.  
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