ナノ粒子による核酸の輸送(10)-応用-

例えば、細胞核内の特定の遺伝子を改変し、
遺伝子治療を行うためには
オフターゲットが無いように
特定の細胞に輸送し、細胞質を通って
核内の特定の遺伝子に作用させる必要があります。
標的となる重要な遺伝子が明らかになり、
その遺伝子を編集したり、
活性を変える事ができれば、
1つ、根本的な治療になりますが、
それを阻んでいるのが細胞特異的な標的性が
困難であるからであると理解しています。

例えば、癌など様々な疾患で
全ゲノム関連遺伝子評価が行われています。
それによって、場合によれば、数百個以上の
遺伝子異常が確認されることがありますが、
病気において重要な複数の遺伝子を見つける事も出来ます。
このような解析を有効にするためには
1つの大きな柱となるのが遺伝子治療です。
重要な遺伝子異常を標的として、
その遺伝子を改変する事ができれば、
病状が改善する可能性があります。
しかし、上述したように
その組織に有効に、特異的に核酸を輸送し、
さらには無数の膜を超えて細胞核まで届けるには
いくつかの大きなハードルがあります。
また、全ゲノム関連遺伝子評価から
標的とする遺伝子(群)を絞り込むところにも
まだ課題がある可能性があります。
個人差が大きければ、それも阻害要因となります。

そのような標的性以外にも
導入するナノ粒子が
例えば免疫的な拒絶反応が起こらないような
生体内で安全なものが強く求められています。
上述した免疫系は異物に対する高い除去能力を持っています。
通常、静脈注射などによる循環器を通した輸送では
血中に多種多様な免疫細胞が存在しているので
その複雑な監視を逃れる必要があります。
そのため特にナノ粒子の生体に対する互換性や
ナノ粒子表面の特性が重要になります。

RNAやDNAなどの核酸の輸送における
ナノ材料、ナノ粒子は上述した課題がありますが、
それらを満たす潜在性を有しています。
また、ナノ粒子を使う事によって
特定の遺伝子をオフ/オンにする遺伝子治療だけではなく
〇生物的な分析
〇タンパク質の補充、生成
〇ワクチン
これらにも応用することができます。
例えば、生物学的分析では
マーカー遺伝子、遺伝子のバーコード化によって、
ナノ粒子が標的細胞に届いたかどうか？
といった検査にも使うことができます。
また、遺伝子はタンパク質を生み出す元となる物質なので
タンパク質の分析、補充、生成を
人為的に行うことができます。
ワクチンにおいて
実際に新型コロナウィルスで使われた
mRNAワクチンは上述したナノ粒子によって
自然免疫系細胞まで輸送されていると考えられています。
このワクチンは樹状細胞などで
大量の新型コロナウィルスのSタンパク質を生み出し、そ
れを抗原とした免疫反応を
利用していると考えられています。
従って、ナノ粒子、mRNA(核酸)の技術は
現在ワクチンでは広く普及しています。
ーー
Bárbara B. Mendes, João Conniot, Aviram Avital, Dongbao Yao, Xingya Jiang, Xiang Zhou, Noga Sharf-Pauker, Yuling Xiao, Omer Adir. 
(敬称略)ら医療研究グループは
効果的な核酸の輸送デザインの方法と
それによる診断や治療の効果について総括されています(1)。
その内容のうち応用の内容の一部を
読者の方と情報共有したいと思います。

核酸ベースの治療は薬剤による治療の景観を変えるものです。
なぜなら、下流の生理経路であるタンパク質に作用するのではなく、
大元の遺伝子を標的にするからです。
従って、難治性の疾患に対しても長く続く、
もしくは完治するような結果が期待されます。
ナノ粒子ベースの核酸輸送の応用について記述します。

//生物分析//ーー
核酸とナノ粒子の複合体は様々な検体において
超高感度の検出を可能にします。
その検体とは
〇核酸(2)
〇タンパク質(3)
〇小さな分子(4)
〇金属イオン(5)
これらです。
最も優れた例は球形の核酸複合体です。
金ナノ粒子の上にオリゴヌクレオチドらせん構造を
共有結合させることで分析が可能になります。
複数の部位で補完の配列を含む
オリゴヌクレオチド結合部位の存在の中で
これら核酸と金ナノ粒子の結合は
溶液の中で塊を作り、金ナノ粒子の光学特性を変化させます。
例えば、表面プラズマ共鳴が分析の為の現象として
対象となります。
この原理は溶液中のRNA,DNAターゲットの比色分析に
利用されます(2,6)。
この方法は特別な装置を必要としない
新型コロナウィルス感染の裸眼での診断のような
多様な生物分析の応用を可能にします(2)。
核酸と金ナノ粒子は非常に狭域の融点を示し
単一塩基のミスマッチで標的を区別することができます(6)。
アレイベースの遺伝子検出キットは
〇チップの上にオリゴヌクレオチドに固定する事
〇核酸と金ナノ粒子を使用する事によって
作られています。
これらは共に標的遺伝子の異なる領域を補完する
遺伝子配列を含みます。
表面上の銀イオンの金ナノ粒子仲介の触媒反応による還元
を利用して、金ナノ粒子の信号は強調され
その信号を様々方法で読み取ることができます。
その方法とは
〇光散乱(7)
〇表面増強ラマン分光法(8)
〇高感度電気伝導性検査(7)
このアレイベース遺伝子検出技術を組み込んだ自動システムは
臨床現場の感染症の迅速な診断の為、普及しています(9)。
--
信号増強によるタンパク質の超高感度検出は
〇ナノ粒子とDNA2本鎖
〇ナノ粒子と抗体
〇磁性マイクロ粒子と抗体(3)
これらの2元型を形成することで可能になります。
標的タンパク質(例えば、抗原)の存在の中で
ナノ粒子とマイクロ粒子ともに
抗体-抗原相互作用を通して抗原に結合します。
この複合体は磁場をかけることによって
簡単に分離する事が出来ます。
その後、構成要素であるDNAが読み取り可能な
バーコード化された状態で放出され、
それを検出します。
それぞれのナノ粒子を含む複合体は
1回のタンパク質結合イベントごとに
多くのDNAバーコードを輸送するので
顕著な信号増強があります。
標的タンパク質を臨床現場で使われる
従来のタンパク質アッセイよりも
6桁程度強い感度で分析することができます。
この方法は
アルツハイマー病のアミロイドβタンパク質を
脳脊髄液の中から分析する事に応用されています。
これは、従来のELISA、Blottingアッセイなどで
低濃度の為、検出できないケースにおいて適用されます(10)。
上述した拡散やタンパク質の他に
核酸とナノ粒子の複合体によって
小さな分子や金属イオンのような検体も
高感度で分析することができます。
その際
〇DNA結合分子(11)
〇アパタマー-基板相互作用(4)
〇金属イオン依存ヌクレアーゼ活性(12)
これらの物理が利用されます。

//遺伝子抑制//ーー
〇ASOs
〇RNAi 
これらに基づく遺伝子抑制技術は製薬業界によって
推し進められています。
それによって病気の原因となっていると考えられる
標的遺伝子を抑制することが可能です。
これらを実現するための輸送媒体は
〇脂質ナノ粒子(13)
〇ポリマーナノ粒子(14)
〇脂質-ポリマー混合ナノ粒子(15)
〇無機のナノ粒子(16)
これらが選択肢として挙げられています。
ナノ粒子によるASOs、RNAiの全身への輸送は
〇癌
〇心臓血管疾患
〇神経疾患
〇感染症
〇遺伝子疾患
これらの疾患に対して利用が検討されています(17,18)。
ナノ粒子は体内へ投与した後、
肝臓に取り込まれる傾向があります。
従って、肝臓はASOs、RNAiによる遺伝子抑制治療において
重要です。対象となる肝臓に関連がある疾患は
〇脂質異常症(19)
〇感染症(20)
組織常在型の固形癌においても
組織破壊による血管からの滲出の増強や
保持効果のため
特に標的化していなくても
ナノ粒子は病変部位に集まる傾向があります。
それによって遺伝子抑制が可能になります。
内的、外的な刺激に反応するナノ粒子は
より制御性を持って、病変部位に特異的に輸送する
事が可能になります(21)。
その刺激とは
〇pH
〇酵素
〇低酸素
これらの癌の微小環境に関わる刺激を利用します。
それによって腫瘍組織における
遺伝子抑制要素(siRNAなど)の
〇浸入
〇細胞取り込み
〇輸送
これらを高める事ができます(22)。
ASO/siRNAをより精密に標的細胞種に輸送するためには
〇表面リガンドによる標的化
〇生体内でのタンパク質コロナ(付着)の制御
これらが挙げられています。
上の選択肢は細胞種特異的輸送系統(*)の
コンセプトと一致します。
(*)Cell-type specific delivery system
さらに
より効果的、かつ持続性のある遺伝子抑制をしたい場合には
〇患部局所的な投与
これが方法として挙げられています。
対象となる疾患はHIVなどです(23)。
ナノ粒子に封入されたsiRNAとASOsは
消化器系の劣化、分解しやすい環境から核酸を
守ることができます。
それによって消化器系の疾患に対して
ナノ粒子製剤による経口投与での治療が可能になります(24)。
--
核酸に対する化学的な特性修正は
酵素に対する安定性を向上させます。
臨床承認されているASO/siRNA薬剤は
化学的に修正されており、
Onpattroを除いてナノ粒子を必要としません。
〇N-acetylgalactosamine (GalNAc) 
このような標的リガンドと
ASO/siRNAを結合させ、複合体化することで
特定の細胞や組織に特異的な輸送をすることができます。
--
(考察)
これは細胞種特異的輸送系統の
最もシンプルな方法となります。
ナノ粒子表面につける細胞種特異的なリガンドを
そのような胞による内腔を設けずに
直接薬剤に結合させる事によって
環境に暴露はされますが、特異的輸送ができるか？
という観点です。系としてはシンプルになります。
--
このGalNAc–siRNA複合体でFDA承認されているのは
〇急性肝性ポルフィリン症(givosiran)
〇Ⅰ型原発性シュウ酸尿(lumasiran) 
〇高コレステロール血症 (inclisiran)
〇脂質異常症 (inclisiran)
これらの疾患に対してです(25)。
またGalNAc–siRNA複合体治療で強固なパイプラインが
形成され、推し進められているのが肝臓に関連する疾患です。
〇B型肝炎
〇トランスチレチン関連アミロイド症
〇α1-抗トリプシン欠乏症
これらです。
--
このような複合体治療戦略を超えて
ナノ粒子輸送は遺伝子抑制技術を多くの生物応用に
適用する事が可能です。

//遺伝子編集//ーー
現代の遺伝子編集ツールは
〇Zinc-finger nucleases
〇Activator-like effector nucleases
〇CRISPR–Cas9
これらです。
遺伝子抑制と異なり、遺伝子編集技術は
遺伝子配列の特定個所の永続的な修正を可能にします。
ナノ粒子は直接的に遺伝子編集するために
核酸分解酵素を輸送します(26)。
pDNA,もしくはmRNAエンコード遺伝子編集核酸分解酵素
がナノ粒子の中に積載されます。
それによって比較的少数の遺伝子コピーの輸送が可能になり
同じ遺伝子編集効率を達成することができます。
遺伝子編集のためのpDNAもしくはmRNAsの輸送は
遺伝子抑制のためのASOsもしくはRNAiの輸送よりも
難しいとされています。
pDNAもしくはmRNAs。
これらは大きな分子の為、それを収納できる
ナノ粒子が必要であり、かつ細胞内に効率的に
取り込まれる必要があります(27,28)。
現在では
脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子が
非ウィルス媒体としては一番研究が進んでいます。
その理由、化学的構成の制御性の高さと
形成過程を最適化できることです(29)。
また遺伝子積載容量が大きいことも挙げられます。
--
DNA形成の中(pDNA)で遺伝子編集ツールを輸送する事は
いくつかの潜在的な欠点があります。
〇突然変異生成
〇永続的な拡散分解酵素の発現
これらはオフターゲット編集や遺伝子不安定性を導きます。
一方、mRNAの輸送は核酸分解酵素の一時的な発現となり
オフターゲット効果や意図しない遺伝子挿入を
最小化することができます。
トランスチレチン関連アミロイド症のマウスモデルでは
化学的に修正されたsgRNAと
Cas9 mmRNAを脂質ナノ粒子に封入した輸送した結果
97%以上の肝臓で70%の遺伝子編集を可能にしました。
同じように人のケースでも
血清のトランスチレチンレベルが顕著に低下した
と報告されています(NCT04601051)。
標的リガンドがあるナノ粒子による
遺伝子編集物質をコード化したmRNAの輸送は
特定の細胞種の遺伝子を編集する事を可能にするかもしれません。
例えば、免疫細胞であるT細胞、マクロファージなど。
またこのように標的化することで
精緻、かつコストのかかる細胞精製プロセスを
省くことができるかもしれません。
それによりCAR-T細胞治療のための遺伝子編集を
生体内で行うことができる可能性もあります(30)。
ナノ粒子の構成比はCas9 mRNA/sgRNAを輸送する臓器に合わせて
調整する必要があるかもしれません。
それによって組織特異的な疾患に対する
新しい治療の発展に貢献する事ができます(31)。

//考察//ーー
標的化治療では肝臓、血液中など
より標的化されやすい、蓄積しやすい部位から
承認されている事がわかります。
細胞種特異的輸送系統では
それに対する付加価値を提供するため、
〇標的化しにくい臓器も含めた特異的輸送、
〇臓器内の特定の細胞種へのより精密な特異的輸送、
これらを可能にする機能を持たせる必要があります。
特異的リガンド形成技術を確立するとともに
臨床前段階から
本当に標的細胞種まで輸送されたかどうかの確認をする必要があります。
〇遺伝子バーコード技術
〇Organ-on-chip技術、
〇Microfludic技術
などを使って確かめる必要があります。
人への応用、臨床ではそのような確認はより難しくなりますが、
より精密に輸送することができたかどうかの
確認、評価は同様に必要になります。

(参考文献)
(1)
Bárbara B. Mendes, João Conniot, Aviram Avital, Dongbao Yao, Xingya Jiang, Xiang Zhou, Noga Sharf-Pauker, Yuling Xiao, Omer Adir, Haojun Liang, Jinjun Shi, Avi Schroeder & João Conde 
Nanodelivery of nucleic acids
Nature Reviews Methods Primers volume 2, Article number: 24 (2022)
(2)
Moitra, P., Alafeef, M., Dighe, K., Frieman, M. B.  
& Pan, D. Selective naked-eye detection of 
SARS-CoV-2 mediated by N gene targeted antisense 
oligonucleotide capped plasmonic nanoparticles.  
ACS Nano 14, 7617–7627 (2020).
(3)Jwa-Min, N., Shad, T. C. & Mirkin, C. A. Nanoparticle- 
based bio-bar codes for the ultrasensitive detection  
of proteins. Science 301, 1884–1886 (2003).
(4)
Liu, J. & Lu, Y. Fast colorimetric sensing of adenosine 
and cocaine based on a general sensor design 
involving aptamers and nanoparticles. Angew. Chem. 
Int. Ed. 45, 90–94 (2006).
(5)
Liu, J. & Lu, Y. A colorimetric lead biosensor using 
DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles.  
J. Am. Chem. Soc. 125, 6642–6643 (2003).
(6)
Robert, E., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L. 
& Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of 
polynucleotides based on the distance-dependent 
optical properties of gold nanoparticles. Science 277, 
1078–1081 (1997).
(7)
Andrew, T. T., Mirkin, C. A. & Letsinger, R. L. 
Scanometric DNA array detection with nanoparticle 
probes. Science 289, 1757–1760 (2000).
(8)
Charles, C. Y., Rongchao, J. & Mirkin, C. A. 
Nanoparticles with Raman spectroscopic fingerprints 
for DNA and RNA detection. Science 297,  
1536–1540 (2002).
(9)
Walker, T. et al. Clinical Impact of laboratory 
implementation of verigene BC-GN microarray-based 
assay for detection of Gram-negative bacteria in positive 
blood cultures. J. Clin. Microbiol. 54, 1789–1796 
(2016).
(10)
Georganopoulou, D. G. et al. Nanoparticle-based 
detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic 
biomarker for Alzheimer’s disease. Proc. Natl Acad.  
Sci. USA 102, 2273–2276 (2005).
(11)
Han, M. S., Lytton-Jean, A. K. R., Oh, B.-K., Heo, J.  
& Mirkin, C. A. Colorimetric screening of DNA-binding 
molecules with gold nanoparticle probes. Angew. Chem. 
Int. Ed. 45, 1807–1810 (2006).
(12)
Liu, J. & Lu, Y. Accelerated color change of gold 
nanoparticles assembled by DNAzymes for simple  
and fast colorimetric Pb 2+  detection. J. Am. Chem. Soc. 
126, 12298–12305 (2004).
(13)
Yang, L. et al. Efficient delivery of antisense 
oligonucleotides using bioreducible lipid nanoparticles 
in vitro and in vivo. Mol. Ther. Nucleic Acids 19, 
1357–1367 (2020).
(14)
Khan, F. O. et al. Endothelial siRNA delivery in 
nonhuman primates using ionizable low-molecular 
weight polymeric nanoparticles. Sci. Adv. 4, eaar8409 
(2021).
(15)
Wei, T. et al. siRNA nanoparticles targeting CaMKIIγ  
in lesional macrophages improve atherosclerotic 
plaque stability in mice. Sci. Transl. Med. 12, 
eaay1063 (2020).
(16)
Conde, J. et al. Design of multifunctional gold 
nanoparticles for in vitro and in vivo gene silencing. 
ACS Nano 6, 8316–8324 (2012).
(17)
Wen, L. et al. BBB pathophysiology-independent 
delivery of siRNA in traumatic brain injury. Sci. Adv. 7, 
eabd6889 (2021).
(18)
Zhao, W., Hou, X., Vick, O. G. & Dong, Y. RNA delivery 
biomaterials for the treatment of genetic and rare 
diseases. Biomaterials 217, 119291 (2019).
(19)
Zimmermann, T. S. et al. RNAi-mediated gene silencing 
in non-human primates. Nature 441, 111–114 (2006).
(20)
Morrissey, D. V. et al. Potent and persistent in vivo 
anti-HBV activity of chemically modified siRNAs.  
Nat. Biotechnol. 23, 1002–1007 (2005).
(21)
Mura, S., Nicolas, J. & Couvreur, P. Stimuli-responsive 
nanocarriers for drug delivery. Nat. Mater. 12,  
991–1003 (2013).
(22)
Mendes, B. B., Sousa, D. P., Conniot, J. & Conde, J. 
Nanomedicine-based strategies to target and 
modulate the tumor microenvironment. Trends Cancer 
7, 847–862 (2021).
(23)
Woodrow, K. A. et al. Intravaginal gene silencing using 
biodegradable polymer nanoparticles densely loaded 
with small-interfering RNA. Nat. Mater. 8, 526–533 
(2009).
(24)
Wilson, D. S. et al. Orally delivered thioketal 
nanoparticles loaded with TNF-α–siRNA target 
inflammation and inhibit gene expression in the 
intestines. Nat. Mater. 9, 923–928 (2010).
(25)
Debacker, A. J., Voutila, J., Catley, M., Blakey, D. & 
Habib, N. Delivery of oligonucleotides to the liver with 
GalNAc: from research to registered therapeutic drug. 
Mol. Ther. 28, 1759–1771 (2020).
(26)
Zuris, J. A. et al. Cationic lipid-mediated delivery  
of proteins enables efficient protein-based genome 
editing in vitro and in vivo. Nat. Biotechnol. 33, 
73–80 (2015).
(27)
Zhang, H.-X., Zhang, Y. & Yin, H. Genome editing with 
mRNA encoding ZFN, TALEN, and Cas9. Mol. Ther. 
27, 735–746 (2019).
(28)
Xu, C.-F. et al. Rational designs of in vivo CRISPR–Cas 
delivery systems. Adv. Drug Deliv. Rev. 168, 3–29 
(2021).
(29)
Liu, S. et al. Membrane-destabilizing ionizable 
phospholipids for organ-selective mRNA delivery and 
CRISPR–Cas gene editing. Nat. Mater. 20, 701–710 
(2021).
(30)
Parayath, N. N., Stephan, S. B., Koehne, A. L.,  
Nelson, P. S. & Stephan, M. T. In vitro-transcribed 
antigen receptor mRNA nanocarriers for transient 
expression in circulating T cells in vivo. Nat. Commun. 
11, 6080 (2020).
(31)
Cheng, Q. et al. Selective organ targeting (SORT) 
nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and 
CRISPR–Cas gene editing. Nat. Nanotechnol. 15, 
313–320 (2020).