ナノ粒子による核酸の輸送(8)-ナノ粒子特性分析-

例えば、細胞核内の特定の遺伝子を改変し、
遺伝子治療を行うためには
オフターゲットが無いように
特定の細胞に輸送し、細胞質を通って
核内の特定の遺伝子に作用させる必要があります。
標的となる重要な遺伝子が明らかになり、
その遺伝子を編集したり、
活性を変える事ができれば、
1つ、根本的な治療になりますが、
それを阻んでいるのが細胞特異的な標的性が
困難であるからであると理解しています。

例えば、癌など様々な疾患で
全ゲノム関連遺伝子評価が行われています。
それによって、場合によれば、数百個以上の
遺伝子異常が確認されることがありますが、
病気において重要な複数の遺伝子を見つける事も出来ます。
このような解析を有効にするためには
1つの大きな柱となるのが遺伝子治療です。
重要な遺伝子異常を標的として、
その遺伝子を改変する事ができれば、
病状が改善する可能性があります。
しかし、上述したように
その組織に有効に、特異的に核酸を輸送し、
さらには無数の膜を超えて細胞核まで届けるには
いくつかの大きなハードルがあります。
また、全ゲノム関連遺伝子評価から
標的とする遺伝子(群)を絞り込むところにも
まだ課題がある可能性があります。
個人差が大きければ、それも阻害要因となります。

そのような標的性以外にも
導入するナノ粒子が
例えば免疫的な拒絶反応が起こらないような
生体内で安全なものが強く求められています。
上述した免疫系は異物に対する高い除去能力を持っています。
通常、静脈注射などによる循環器を通した輸送では
血中に多種多様な免疫細胞が存在しているので
その複雑な監視を逃れる必要があります。
そのため特にナノ粒子の生体に対する互換性や
ナノ粒子表面の特性が重要になります。

RNAやDNAなどの核酸の輸送における
ナノ材料、ナノ粒子は上述した課題がありますが、
それらを満たす潜在性を有しています。
また、ナノ粒子を使う事によって
特定の遺伝子をオフ/オンにする遺伝子治療だけではなく
〇生物的な分析
〇タンパク質の補充、生成
〇ワクチン
これらにも応用することができます。
例えば、生物学的分析では
マーカー遺伝子、遺伝子のバーコード化によって、
ナノ粒子が標的細胞に届いたかどうか？
といった検査にも使うことができます。
また、遺伝子はタンパク質を生み出す元となる物質なので
タンパク質の分析、補充、生成を
人為的に行うことができます。
ワクチンにおいて
実際に新型コロナウィルスで使われた
mRNAワクチンは上述したナノ粒子によって
自然免疫系細胞まで輸送されていると考えられています。
このワクチンは樹状細胞などで
大量の新型コロナウィルスのSタンパク質を生み出し、そ
れを抗原とした免疫反応を
利用していると考えられています。
従って、ナノ粒子、mRNA(核酸)の技術は
現在ワクチンでは広く普及しています。
ーー
Bárbara B. Mendes, João Conniot, Aviram Avital, Dongbao Yao, Xingya Jiang, Xiang Zhou, Noga Sharf-Pauker, Yuling Xiao, Omer Adir. 
(敬称略)ら医療研究グループは
効果的な核酸の輸送デザインの方法と
それによる診断や治療の効果について総括されています(1)。
その内容のうちナノ粒子の分析の内容の一部を
読者の方と情報共有したいと思います。

//ナノ材料の構成比と合成//ーー
生物学的な相互作用はナノ材料の構成比によって
強く影響を受けます。
従って、その構成比を分析し、明らかにすることは
ナノ材料の特性を同様に明らかにするうえで
非常に重要です。
しかしながら、
その材料の構成比の分析手法は
その材料によって全く異なります。
従って、
合成手法や構成比の分析においては
関係する人々の協力的な努力によって
そのプロトコルを明かにすることが重要です。
特別な注意が必要で、難しいステップについては
特にそれを明かにする必要があります。
合成や分析方法の例については
Buriak, J. M.氏らによって報告されています(2)。
精製方法についても同様です。
最終的なナノ材料において前駆物質の存在が
生物学的効果を変えるかもしれないからです(3)。

//表面状態と大きさの偏差//ーー
ナノ粒子のサイズと形(表面状態)は
ナノ粒子の重要な経路に影響を与えます。
例えば、ナノ粒子が標的細胞に取り込まれる効率が
サイズや形によって影響を受けます(4,5)。
また、免疫系による除去や
肝臓や脾臓での代謝においても
サイズや形によって影響を受けます。
加えて、
ナノ粒子のサイズと形は生体内での
デブリを含むタンパク質などの吸着、
あるいは生体内での分布に影響を与えます(6,7)。
球径の粒子であれば、
その径が主要な評価項目となります。
しかしながら、箱型やロッド型のような他の形では
縦、横、奥行きなどそれぞれの次元の大きさが
基本的に重要になります。
また、生体外で設計されたナノ粒子が
生体内で大きさを変える事も想定する事が大切です。
循環器でタンパク質、脂質、核酸など
様々な物質と相互作用し、それらが吸着することで
作用するための大きさが変わることがあります(8,9)。
また、作製したナノ粒子は大きさの偏差、ばらつきがあります。
それらの偏差が生物学的なナノ粒子の相互作用に
影響を与えます(10)。
--
いくつかの方法によってナノ粒子の表面状態と
サイズの偏差を評価することが考えられてきました(11)。
それぞれの項目の評価は
ウェット(懸濁液)もしくはドライ状態によって
行われています。
無機金属のナノ粒子と異なり、
有機のナノ粒子の表面状態は評価環境が
ウェットかドライかで変わってしまいます。
また、大きさにおいても同様で
こちらはより顕著です。
従って、評価プトトコルをガイドライン化する事は
求められます。条件を揃えるためにです。
動的光散乱(DLS)で光学的に大きさを調べる事は
特にウェット、懸濁液の中でナノ粒子の
大きさを調べるのに適しています(11)。
この方法は懸濁液のナノ粒子のブラウン運動から
光学的散乱状態を分析する事で
ナノ粒子の径を求める事ができます。
その適用範囲は
粒子径が5nm～10μmまでです。
評価時間は短く、
懸濁液の種類の制限は少ないですが、
サンプルの量は少なくする必要があります。
動的散乱法によるサイズの評価は
散乱強度によって行われます。
従って、前述したように
サンプルの量が多くなり、
懸濁液の中での密度が高くなると
散乱情報が上手く得られなくなると考えられます。
しかしながら、
懸濁液中の動的散乱法によるナノ粒子のサイズの評価は
ナノ粒子が球形であれば、
最も効果的な評価手法であると考えられています(12,13)。
--
サイズの分析はナノ粒子の軌道解析によって
行うことができます。
それは懸濁液中の粒子遊離拡散モデルに基づきます。
〇強調コントラスト顕微鏡(Enhanced contrast microscopy)
〇時間分解能動画撮影(temporal-resolution video acquisition)
これら手法によって
懸濁液中のナノ粒子の拡散状態が測定されます。
それは単一粒子のランダム動作を追跡することによって
分析が行われます(14)。
今述べた様にナノ粒子軌道分析は
単一粒子の空間分解能を持つ動画撮影法が必要になるので
多分散系の分布が好ましく、
30nm～1μmの水力学径(hydrodynamic diameters)を決定します。
しかしながら、
ナノ粒子の軌道解析の広範な応用は制限的です。
なぜなら、DLSに比べて高価だからです。
また懸濁液中の粒子濃度も定められています(11)。
(10^9 particles/ml)
--
ドライ環境でのナノ粒子の分
透過型電子顕微鏡(TEM)が一つの重要な分析手法です。
TEMは電子線を使って、電子線が透過するほど
極めて薄く加工したサンプルを評価して
分子オーダーの分解能でサンプルの径や
表面状態を評価する事ができます。
適用できるナノ粒子径は1nm～1μmです(11,15)。
しかしながら、前述したように
TEMは薄く加工する必要があるので
労力が必要です。
従って、多くのサンプルを測る事は現実的ではありません。
また、有機物質は特に柔らかいので
サンプルが電子線によって動いたり、
あるいは形を変えたり、ダメージを受けたり
する可能性もあります(16,17)。
例えば、凍らせるという方法もありますが、
そうすると今度はその温度変化によって
元々の情報、特性が変わってしまう可能性もあります。
一方、
低温電子顕微鏡は近年
タンパク質、核酸などの構造分析の為
広く使われています。
これをナノ粒子の分析に使う事も出来ます。
しかし、同様に電子線によるダメージが想定されます(18)。
他の方法として
走査型電子顕微鏡法があります。
サンプル表面からの2次電子を分析する方法です。
TEMに比べて、低い電子線強度で分析する事ができますが、
分解能が2nm～3nmに低下します。
一方、電子線強度を下げて分析すれば、
ダメージを減らすことができます。
SEMの場合はチャージアップによる
明コントラストによるノイズを減らすため、
事前の準備として、ナノ粒子表面に
数nm程度の薄い白金などの膜を付ける必要があります。
そのうえで、形状や大きさを評価する事になります。
--
原子間力顕微鏡法(AFM)は鋭利に尖らせた針を
サンプルに極限まで近づける事に寄って
そこで生じた分子間力から
針の動きを光学的に分析することで
表面の形状を評価することができます。
しかし、サンプル表面の段差の大きさによって
分析できない事も考えられるので、
カンチレバーのヤング率などの強度の最適化などが
必要になるかもしれません。
原子間力顕微鏡は大きさの評価よりも
どちらかというと表面形状の評価に適しています。
しかし、観察できる範囲が限られているので
多くのサンプルを広範囲に測定する事は
労力の観点で難しいです。

//ゼータ電位//ーー
ナノ粒子の正と負の表面電荷は細胞の反応に
強く影響を与えるだけではなく、
経路でのタンパク質、脂質、核酸などの
ナノ粒子表面の付着や
ナノ粒子の生体内分布にも影響を与えます(4,19,20)。
表面電荷は評価の為に使われる懸濁液に対する
ナノ粒子の安定性に影響を与えます(21)。
ゼータ電位は周辺環境によって変わります。
例えば、pH, 電解質濃度です。
従って、評価の為に使われた条件を
情報の受け手側に対して明らかにすることは
必要条件となります(10)。

//薬物封入と放出//ーー
ナノ粒子に薬物などを封入する事を決めている場合
封入された量を計算することが求められます。
なぜなら、用量に関わる重要な問題だからです。
従って、重量に対する分子、粒子の濃度を
報告する必要があります。
そこから積載される、あるいは放出される
内容物、薬物の量の詳細を明らかにすることが
少なくとも最終的に臨床応用されるときには
必要になります(10,22)。

//標的性//ーー
ナノ粒子は特異的な細胞、組織に高い親和性を持つように
表面タンパク質などのリガンドが特別に設計される
ことが想定されます(4)。
これは細胞特異的輸送系統(*)のコンセプトです。
(*)Cell-type-specific delivery system
このような特異的輸送は
ナノ粒子の物理化学的特性を元に達成されます。
例えば、
〇サイズ
〇形
〇表面化学的特性(4)
〇共有結合性(23)
〇静電気的相互作用(24)
これらです。
どれくらいの程度で特異的輸送されるかは
リガンドの量や複合体の選択によって変わります。
薬剤では用量の情報が非常に重要になるので
その用量の可変性を決める
サイズ、形、共有結合性、静電気特性などに加えて
リガンドの量や複合体の選択の情報も
受け手に定量的に示す必要があります。
しかしながら、
この情報提供は非常に難解です。
なぜなら、どれくらい生体内で届くか
事前に人で分析することが非常に困難だからです。
しかし、その作業を省くことはできません(10)。
この作業について
濃度を評価する手法が開発されてきています。
最終的にはこの分析手法は
ガイドラインに指定される必要があります(25)。

//考察//ーー
世界の医療に関わる研究者の方は
「Precision medicine(個別化医療)」を
どれくらいの精度で想定されているでしょうか？
もし、一人一人変えるとなると
内科的には薬も一人一人合うように調整する必要があります。
もし、
小児のⅠ型糖尿病に対して
5つのサブタイプがあるとします。
その区分が5つであれば、
5種類の内科的な治療で行われることになります。
患者さんが1万人いれば、
そこから5グループに分けられるということです。
これは冒頭で述べる個別化医療でしょうか？
ーー
ナノ粒子の治療では効率的に薬剤を届ける
という事もありますが、
Bárbara B. Mendes氏らの報告にもあるように
拡散の輸送において期待されています。
その場合、作用させる遺伝子は
遺伝子分析結果に基づいて変える必要性があります。
具体的には内容物の核酸を変えることです。
あるいは、
ナノ粒子の表面リガンドや
中に封入させる薬の種類、量なども変える
ことも想定されます。
そうした場合、
難しい壁に直面します。
作用する薬の量が大きく変化してしまうと
過少投与、過剰投与の原因となってしまいます。
それは、治療の上で絶対に避けないといけない項目です。
従って、
ナノ粒子を使った治療をより安全で、広範な疾患に応用し
かつ個別化医療の選択肢の一つとするためには
Bárbara B. Mendes氏らが述べているように
薬が標的細胞でどれくらい放出されるか？
といった信頼できる分析プロトコルを開発する事は
少なくとも必要です。

(参考文献)
(1)
Bárbara B. Mendes, João Conniot, Aviram Avital, Dongbao Yao, Xingya Jiang, Xiang Zhou, Noga Sharf-Pauker, Yuling Xiao, Omer Adir, Haojun Liang, Jinjun Shi, Avi Schroeder & João Conde 
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