ナノ粒子による核酸の輸送(6)-ポリマーナノ粒子-

例えば、細胞核内の特定の遺伝子を改変し、
遺伝子治療を行うためには
オフターゲットが無いように
特定の細胞に輸送し、細胞質を通って
核内の特定の遺伝子に作用させる必要があります。
標的となる重要な遺伝子が明らかになり、
その遺伝子を編集したり、
活性を変える事ができれば、
1つ、根本的な治療になりますが、
それを阻んでいるのが細胞特異的な標的性が
困難であるからであると理解しています。

例えば、癌など様々な疾患で
全ゲノム関連遺伝子評価が行われています。
それによって、場合によれば、数百個以上の
遺伝子異常が確認されることがありますが、
病気において重要な複数の遺伝子を見つける事も出来ます。
このような解析を有効にするためには
1つの大きな柱となるのが遺伝子治療です。
重要な遺伝子異常を標的として、
その遺伝子を改変する事ができれば、
病状が改善する可能性があります。
しかし、上述したように
その組織に有効に、特異的に核酸を輸送し、
さらには無数の膜を超えて細胞核まで届けるには
いくつかの大きなハードルがあります。

そのような標的性以外にも
導入するナノ粒子が
例えば免疫的な拒絶反応が起こらないような
生体内で安全なものが強く求められています。
上述した免疫系は異物に対する高い除去能力を持っています。
通常、静脈注射などによる循環器を通した輸送では
血中に多種多様な免疫細胞が存在しているので
その複雑な監視を逃れる必要があります。

RNAやDNAなどの核酸の輸送における
ナノ材料、ナノ粒子は上述した課題がありますが、
それらを満たす潜在性を有しています。
また、ナノ粒子を使う事によって
特定の遺伝子をオフ/オンにする遺伝子治療だけではなく
〇生物的な分析
〇タンパク質の補充、生成
〇ワクチン
これらにも応用することができます。
例えば、生物学的分析では
マーカー遺伝子、遺伝子のバーコード化によって、
ナノ粒子が標的細胞に届いたかどうか？
といった検査にも使うことができます。
また、遺伝子はタンパク質を生み出す元となる物質なので
タンパク質の分析、補充、生成を
人為的に行うことができます。
ワクチンにおいて
実際に新型コロナウィルスで使われた
mRNAワクチンは上述したナノ粒子によって
自然免疫系細胞まで輸送されていると考えられています。
このワクチンは樹状細胞などで
大量の新型コロナウィルスのSタンパク質を生み出し、そ
れを抗原とした免疫反応を
利用していると考えられています。
従って、ナノ粒子、mRNA(核酸)の技術は
現在ワクチンでは広く普及しています。
ーー
Bárbara B. Mendes, João Conniot, Aviram Avital, Dongbao Yao, Xingya Jiang, Xiang Zhou, Noga Sharf-Pauker, Yuling Xiao, Omer Adir. 
(敬称略)ら医療研究グループは
効果的な核酸の輸送デザインの方法と
それによる診断や治療の効果について総括されています(1)。
その内容の一部について
読者の方と情報共有したいと思います。

//ポリマーナノ粒子//ーー
ナノ粒子キャリアとして使用される
ポリマーナノ粒子は自然のポリマーが使われます。
〇Dextran
〇Chitosan
〇Cyclodextrins
〇Synthetic polymers
これらで
PLL, PEI, PAMAM, PLGA
これらを含みます。
これらの選択性は多種多様なポリマーナノ粒子の
製造を可能にします。
これらの複数の材料の構成比が最適化されます。
-
ナノ粒子の形状は
〇Nanocapsules(*1)
(*1)ポリマー膜、シェルによって覆われた
内側液性キャビティーによって閉じ込められた
薬剤から成る典型的なコアシェル構造
〇Nanospheres(*2)
(*2)ポリマーマトリックス捕獲された
、もしくはナノ粒子表面に吸着した
薬剤から成る連続的なポリマー網構造からなる
固形のマトリックスシステム
これらです。
-
これらは
〇Polyplexes
〇Polymersome(*3)
(*3)ポリマーシェルによって覆われた
水性内側層からなるポリマー性輸送媒体であり、
両親媒性のブロックコポリマーの自己組織化
によって形成される。
〇Dendrimers(*4)(Ref.(1) Figure 2参照)
(*4)中心コア(青部分)、枝状連続ユニット(赤部分)、
端部グループ(青緑部分)からなる
3次元、ナノスケール、超枝構造をもつ樹状ポリマー
端部は枝状ユニットを架橋しています。
-
これらをサブクラスとして持ちます。
ポリマーナノ粒子は人工的な材料としては
ナノ粒子輸送薬剤システムにおいて
最も有望な選択肢であると考えられています。
その理由は
〇単純な合成方法(易製造性)
〇易機能化
〇構造的な多様性
〇量産性
〇容易な核酸封入
〇遺伝子免疫原性
〇良い生体互換性
これらが挙げられています。
--
ポリマーナノ粒子に核酸が封入されたPolyplexesは
陽イオン性ポリマーを含みます。
このイオン性による静電気的相互作用から
核酸を小さな構造の中に濃縮します。
このイオン性を制御するためには
オリゴヌクレオチドに対する陽イオン性ポリマーの
比率を増やすことで可能になります。
そのイオン性によって上述したように
核酸を小さな空間に閉じ込めることができます。
核酸は糸状のポリマーマトリックスに捕獲され
その鎖状のポリマーの入り組んだ構造により
核酸分解酵素よって分解されるのを防ぐことができます。
パッキングする際の安定性は
アルキル基などの疎水性要素の導入によって向上します。
また疎水性によって凝集が起こり、
自然形成、自己組織化によってナノ粒子が形成されます。
また粒子コア内にある共有結合性のクロスリンカーの
導入もナノ粒子形成に貢献します。
このような疎水、親水性の特性は
ナノ粒子自己組織化形成に影響を与えるものです。
Polymersomeでは両親媒性に対する親水性割合の
最適値は35±10%です(2)。
Polymersomeの製造方法は
リポソーム製造プロトコルを適用しています。
〇Direct dissolution of copolymer
ポリマー複合体の分解
〇Film rehydration
膜の水和
〇Solvent exchange
溶媒交換
〇Probe sonication
超音波処理
これらです。
--
様々な核酸(pDNA, ASOs, siRNA)は
内側水性コアの中に安定して封入されます。
Polymersomeの中に自己組織化した
ブロックポリマーが核酸を安定して封入します。
この生物マクロ分子の親水性の特徴によって
それが可能になります。
例えば、
水性溶液の中でdiblock copolymer 
poly(1,2-butadiene)-b-poly(ethylene oxide) 
の膜水和によって形成されたポリマーナノ粒子は
siRNAの封入効率51%を達成しました(3)。
3種類からなるコポリマーから形成された
非対称性を膜を持つPolymersomeは
内側の水性コアの体積を向上させます。
それによって核酸の封入効率が向上します(4)。
このように核酸の封入効率を上げるために
核酸と膜の静電気的な相互作用を利用する事が有効です。
従って、Polymersomeはイオン化膜が適用される
ことがあります(5)。
従って、コアの内層の水性の層は
核酸をナノ粒子の中に効率的に封入する上で
重要な役割を担っているといえます。
--
Dendrimersは繰り返しの一連の反応ステップによって
合成されます。
このような連続的、かつ繰り返しの反応ステップは
枝構造の追加的な生成を促します。
このような反応サイクルの数によって
Dendrimersの構造が決まってきます。
Dendrimersの端部、表面の構造によって機能化されます。
それは活性な端部特性を持つ枝構造を選択することによって
機能化させたい他の分子と反応させ、
複合体化を通して機能化させることができます。
PAMAM, poly(propylene imine), PLL
これらのようなDendrimersは
ターミナルアミン基を持ち、
イオン性の相互作用を持って、核酸と結合します。
例えば、
PAMAM G5 dendrimerを持つ
Triple-helix strandsのmRNAの複合体によって
形成されたRNAナノ粒子は
枝分かれしたスポンジ様のナノ構造を持ち
乳癌微小環境のキーとなる遺伝子ドライバーを
制御するために使われています(6)。
--
Polyplexes, dendrimers。
これらに対して、ナノ粒子表面への
親水性ポリマーPEGの複合体化は
血中の安定性、生体互換性を向上させます(7,8)。
これは脂質ナノ粒子をPEG装飾する結果と一致します。
これらのポリマーナノ粒子は
脂質ナノ粒子と同様に表面に
抗体、トランスフェリン、葉酸、グリコシド
などを結合させる事によって
これらの装飾因子と相互作用の強い細胞において
その標的性を上げる事ができます(9)。
ポリマーナノ粒子にアミン基を加える事により
水素イオンを細胞質からエンドソームに引き込む
プロトンスポンジ効果によって
エンドソームからナノ粒子の細胞質への
滲出を促すことができます(10)。

(参考文献)
(1)
Bárbara B. Mendes, João Conniot, Aviram Avital, Dongbao Yao, Xingya Jiang, Xiang Zhou, Noga Sharf-Pauker, Yuling Xiao, Omer Adir, Haojun Liang, Jinjun Shi, Avi Schroeder & João Conde 
Nanodelivery of nucleic acids
Nature Reviews Methods Primers volume 2, Article number: 24 (2022)
(2)
Discher, D. E. & Ahmed, F. Polymersomes. Annu. Rev. 
Biomed. Eng. 8, 323–341 (2006). 
(3)
Pangburn, T. O., Georgiou, K., Bates, F. S. & Kokkoli, E. 
Targeted polymersome delivery of siRNA induces cell 
death of breast cancer cells dependent upon orai3 
protein expression. Langmuir 28, 12816–12830 
(2012).
(4)
Konishcheva, E. V., Zhumaev, U. E. & Meier, W. P. 
PEO-b-PCL-b-PMOXA triblock copolymers:  
from synthesis to microscale polymersomes with 
asymmetric membrane. Macromolecules 50,  
1512–1520 (2017).
(5)
Li, S. et al. Biodegradable polymersomes with an 
ionizable membrane: facile preparation, superior 
protein loading, and endosomal pH-responsive protein 
release. Eur. J. Pharm. Biopharm. 82, 103–111 
(2012).
(6)
Conde, J., Oliva, N., Atilano, M., Song, H. S. &  
Artzi, N. Self-assembled RNA-triple-helix hydrogel 
scaffold for microRNA modulation in the tumour 
microenvironment. Nat. Mater. 15, 353–363 (2016).
(7)
Palmerston Mendes, L., Pan, J. & Torchilin, V. P. 
Dendrimers as nanocarriers for nucleic acid and  
drug delivery in cancer therapy. Molecules 22, 1401 
(2017).
(8)
Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S. & Stayton, P. S. 
Design and development of polymers for gene delivery. 
Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581–593 (2005).
(9)
Mitchell, M. J. et al. Engineering precision 
nanoparticles for drug delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 
20, 101–124 (2021).
(10)
Lai, W.-F. & Wong, W.-T. Design of polymeric  
gene carriers for effective intracellular delivery.  
Trends Biotechnol. 36, 713–728 (2018).