RNA治療におけるナノ粒子薬剤輸送システム

//背景//ーー
脂質ナノ粒子を使ったmRNAワクチンが
広く新型コロナウィルス感染症の予防のために使われたことで
効果、安全性など大規模なデータが得られています。
これによりmRNAワクチンは新型コロナウィルスだけではなく
他の感染症のワクチンにおいても開発が進んでいます。
例えば、HIVに対するmRNAワクチンの画期的な報告があります(2)。
さらにはより広範なナノ粒子を使ったRNA療法に利用できます。
感染症以外には、癌、免疫疾患、神経疾患などです(1)。
-
想定されているRNA療法としては
①Antisense oligonucleotides(ASOs)
②Small interfering RNA(siRNAs)
③Messenger RNA(mRNA)
これらがあります(参考文献(1)Fig.1)。
これらの技術により
・特定のRNA,タンパク質を標的とする
・欠損しているタンパク質を補う
・特定のDNA, RNAを遺伝子編集する
これらの薬理作用を目的としています(1)。
上述したASOs, siRNA, mRNAを保護しながら
特定の細胞まで輸送するにはそれを覆うナノ粒子が必要です。
その種類としては
A:ウィルス
B;ポリマー
C;脂質
などが挙げられています(1)。
選択肢Aのウィルスは臨床試験における成功が得られています(3-8)。
一方で、いくつかの課題が生じています。
〇ウィルスに誘発された免疫原性(9)
〇余分な遺伝子の導入(10)
〇積載物質量の制限(11)
〇再投薬に関する制限
〇量産の困難性(12)
〇高い製造コスト
これらが挙げられています。

//承認実績//ーー
ポリマー、脂質ナノ粒子を使ったRNA薬剤で
FDAもしくはEUAによって承認されているもの
・N-acetylgalactosamine(GalNAc)–siRNA複合体
これは肝細胞を標的としたものです(13-15)。
・LNP-based siRNA 
これは肝細胞を標的としたものです(16)。
・脂質ナノ粒子mRNAワクチン
新型コロナウィルス感染症に対するものです(17,18)。
ー
肝臓以外に現在想定されている部位は
・中枢神経系
・目、耳
これらです。

//総括内容//ーー
Kalina Paunovska, David Loughrey & James E. Dahlman(敬称略)らは
・①ASOs、②siRNAs、③mRNA
・脂質、ポリマーナノ粒子
・組織標的性(Passive and Active)
・臨床に向けたパイプライン
これらについて総括しています(1)。
Cell-type-specific delivery system(細胞種特異的輸送系統)。
これの視点を含めながら内容の一部について
読者の方と情報共有したいと思います。

//①ASOs//ーー
(概要)
AS0sはRNaseH1タンパク質を引き付ける事で
(Pre)mRNAに作用し、特定の遺伝子発現に影響を与え、
その遺伝子コードのタンパク質の生成、抑制を実現する技術です。
-
(機能1)
RNaseH1-ASOsは特定のRNAをへき開して
そのRNAによって生成されるたんぱく質を生成を抑制します。
この場合は②siRNAと同じように
・高コレステロール血症(19)
・神経向性を持つhATTRアミロイド症(20)
これらに適用されます。
(機能2)
ASOsはpre-mRNAにおけるスプライシング機能に干渉し
標的タンパク質の発現を向上させます(21)。
従ってタンパク質が不足する
・デシェンヌ型筋ジストロフィー
・脊髄性筋萎縮症
この治療への適用が検討されています。
(機能3)
mRNA翻訳機能に関わるコドンに結合することで
標的タンパク質の翻訳を停止させる機能です(22)。
-
ASOsは機能2に関してはpre-mRNAに作用する必要があるため
細胞核内への輸送が必要になります。
Phosphorothioate:ホスホロチオエート 
これを主鎖とすることで細胞核内への輸送が促進される
という報告もあります(23,24)。

//②siRNAs//ーー
(概要)
siRNAはRISCタンパク質と共にmRNAに作用し
それを切断することで
遺伝子発現を無効にさせる技術です。
-
(臨床実績)※FDA or EMA
・Patisira
Hereditary transthyretin-mediated amyloidosis(hATTR)
このアミロイド症に対して承認されています(16)。
アミロイドが全身もしくは特定の臓器に蓄積し、
機能障害を起こす疾患。
・Givosiran
Acute hepatic porphyria
急性肝性ポリフィリン症に対して承認されています(13)。
ポルフィリン体あるいはその前駆体が蓄積することによって発症する
遺伝子性疾患。
・Lumasiran,
Primary hyperoxaluria type 1
原発性高シュウ酸尿症に対して承認されています(15)。
肝臓内のグリオキシル酸が蓄積する小児慢性特定疾患。
・Inclisiran
Hypercholesterolaemia
高コレステロール血症に対して承認されています(14)。
-
(追記)
特定のタンパク質を作り出すmRNAの機能を喪失させる薬剤システムです。
従って、遺伝子性の余分なたんぱく質が機能障害を起こしている
疾患に対して承認されています。
-
このsiRNAを使った技術は真核生物でRNAの機能を
喪失させる(RNAi)生理が見つかってから20年で
臨床承認されています(16)。
この理由は
〇siRNAのヌクレオチド数が少ない(13kDa)
これにより特定の遺伝子サイトを標的としたsiRNAの製造において
固相による合成が可能であったこと。
〇RISCタンパク質は真核細胞内に存在していること。
従って、これを引き付けるための大きな酵素を輸送する
必要がなかったこと。
〇細胞核内ではなく、細胞質への輸送である事。
これらの3つの要因が技術的障壁を押し下げたとされています(1)。

//③mRNA//ーー
(概要)
mRNAはASOs, siRNAと比べて分子数が大きいです。
(340～2300kDa (compared to 6～24 kDa))
従って、標的性を持った輸送には適していないとされています(1)。
一方、
・タンパク質を入れ替える(25)
・Cas9に作用することでタンパク質レベルを下げる(26)
・DNAを遺伝子編集することで変異タンパク質を修復する(27)
・任意のタンパク質を生成する
-
(mRNAワクチン)
主に免疫細胞内に入って、任意のタンパク質(抗原)を作ることで
その抗原に対応した抗体を作るようにします。
新型コロナウィルスで承認、実用化されました(28,29)。
上述したHIVワクチンの他に
・Zikaウィルス(30)
・インフルエンザ(31)
・メラノーマ(32)
これらに対するmRNAワクチンの開発が進んでいます。
-
mRNAは寿命が短いため、その効果は一時的である
と考えられてます(33)。
そのことが新型コロナウィルスワクチンによる
長期的な懸念を小さくし、適していると考えられています(34,35)。

//脂質ベースナノ粒子//ーーー
((背景))
新型コロナウィルスのmRNAワクチンにおいては
脂質ナノ粒子に焦点があてられることは稀ですが、
このナノ粒子の構造、構成比は思っている以上に複雑で
今までに多くの団体によって多くの資源が投入されたと想定されます。
なぜなら、輸送の効率は到達部位によっても異なります。
また同じ部位であっても脂質ナノ粒子の構造や表面状態(電荷など)
によっても異なります。
脂質は体内で化学的に容易に合成されてしまうため
今まで少なくとも10を超える団体によって
数千種類以上の構造を持つ脂質ナノ粒子が試作され
その中で輸送効率が評価されてきました(36,37)。
その軌跡において改善は著しく
生体内の肝細胞の遺伝子抑制の効率は「マウスのケース」で
1.0mg/kg(38)から0.002mg/kg(39)
この程度で改善しました。500倍の改善です。
-
((脂質ナノ粒子の粒子構造))
大きく3つに分かれます
・ミセル構造
・リポソーム構造
・ナノ粒子構造
(Ref.(1) Fig.2a参照)
-
((脂質ナノ粒子の種類))
FDAによって承認されている脂質ナノ粒子は以下です。
(1)コレステロール: 1種類
(2)ヘルパー脂質(DSPC)：1種類
(3)PEG脂質
(4)カチオン、イオン化脂質
これら(3)～(4)に対して以下の種類のナノ粒子があります。
(3)PEG脂質
・PEG-2000-C-DMG (Alnylam)
・ALC-0159 (Pfizer/BioNTech/Acuitas)
・PEG-2000-DMG (Moderna)
(4)カチオン、イオン化脂質
・cKK-E12
・C12-200
・ALC-0315 (Pfizer/BioNTech/Acuitas)
・Lipid H(Moderna)
・SM-102(Moderna)
・FTT5(Ohio State and Beam Therapeutics)
・DLin-MC3-DMA (Alnylam)
・Intellia LP01(Intellia Therapeutics)
・DLin-KC2-DMA
-
((影響を与える因子))
(1)コレステロール(2)ヘルパー脂質(3)PEG脂質
これらを変えることでマウスのケースで
siRNA, mRNAの輸送効率が
・肺血管
・心臓血管内皮細胞
・骨髄細胞
・肝細胞
・脾臓内皮細胞
これらの部位に対して静脈注射の条件で変化しました(40-42)
(3)PEG脂質の3種類の構造、構成比を変えることで
siRNAの輸送効率が
・目
・肝臓
これらの部位に対して変化しました(43,44)。
(1)コレステロールにおいて
酸化、エステル化、類似物(植物ステロール)
これらに変えることで輸送効率が向上しました(45-47)。
-
((今後の期待))
Intellia Therapeutic(48)とBeam Therapeutics(49)は
造血幹細胞への輸送をマウスのケースで成功しています。
今後、造血幹細胞を標的とした遺伝子治療が期待されています(1)。

//ポリマーベースナノ粒子//ーーー
ポリマーベースのナノ粒子を使ったRNA療法において
その輸送効率はナノ粒子の
・電荷
・化学的耐性
・分子量
これらによって変わるとされています(50,51)。
-
((種類))
<ポリマーナノ粒子>
・PLGA
・Branched PEI
・PLL
・PBAE
<デンドリマー>
・PAMAM dendrimer
(Ref.(1) Fig.3参照)
-
・PLGA
これはASOsやsiRNAのような低分子量の薬剤の場合を
包む場合には少なくとも一部、FDAによって承認されてきましたが
細胞核への輸送の為のナノ粒子としては未承認です(52)。
・PEIとPLL
これらはRNAと静電気的に相互作用し、
RNAが細胞内に輸送されることが知られています(53,54)。
PEIは分子量が多くなると毒性が強まる傾向にあります(55)。
これらは以下のように構造改変されます
*PEG- grafted PEI(56)
*Cyclodextrin- PEI(57)
*酸化鉄ナノ粒子 surface modified with PLL(58)
・PBAE
生体内で分解されやすいが細胞毒性が強い(59)
・PAMAM dendrimer
以下の用途で研究されています。
*中枢神経系へのRNA輸送
*Ebola出血熱RNAワクチン
*H1N1インフルエンザRNAワクチン
*肝臓内皮細胞へのsiRNA輸送
これらです(60-62)。

//ナノ粒子の特異的輸送//ーー
参考文献(1)Fig.4に示されているように
受動的、能動的な標的があります。
受動的とは意図的に事前に設計せず、
体内で取り込まれた物質を標的化のために利用する
というシステムです。
例えば、AroEは肝細胞への特異的輸送を高めてくれるもので
体内でナノ粒子に吸着します(63)。
一方、
承認されているsiRNAに複合体として結合させる
GalNAcはAsialoglycoprotein受容体に対して結合親和性を
持っていると考えられており、
この受容体も肝細胞にある事が知られています。
この場合は事前に結合させたGalNAcが輸送の特異性を上げているので
能動的な標的システムということになります。
また、一般的な傾向として
〇疎水性の粒子は肝臓
〇親水性の粒子は腎臓
これらに蓄積しやすいとされています(64)。
ナノ粒子として使われるコレステロールに関して
血中にはLDLとHDLがあります。
HDLのほうが疎水性の性質が低いので
肝臓に蓄積しにくいと考えられます(65)。
-
抗体薬物複合体は薬剤と抗体をへき開可能な物質によって
架橋させて、抗体に結合親和性のある組織まで
特異的に輸送することを目的とします。
同様にナノ粒子でも
ナノ粒子の周りに抗体を装飾させて
特異的輸送を実現しようとする試みがあります。
Anchored Secondary scFv Enabling Targeting(ASSET)では
ナノ粒子の輸送ではおそらく肝臓以外の
標的となる組織にどのように輸送するか考えられます。
つまり肝臓に蓄積しないような構造にする必要があります。
例えば、炎症性腸炎に対しては
特異的に発現されているインテグリンα4β7の構造に対して
結合親和性のある抗体をナノ粒子に結合させる事が
試みられています(66)。

//臨床応用へのパイプライン//ーー
ナノ粒子を使った薬剤を人への応用、臨床試験に向かわせるためには
参考文献(1)Fig.5のように候補となるナノ粒子を絞り込む必要があります。
試験管レベルでは数千種類というナノ粒子を選択して
実験結果を得る事ができますが、
マウスの実験になるとその数を激減させ、10以下にする必要があります。
しかし、試験管の結果と生体内の結果は必ずしも整合しないので
生体内においてナノ粒子の選択性を現実レベルの実験規模で
上げていく必要があります。
Kalina Paunovska氏、 David Loughrey氏 James E. Dahlman氏が
過去の報告から抽出し、提示しているのはDNAバーコード化です。
それによってナノ粒子の種類の生体内の作用の痕跡を
個別に得る事ができると理解しています。
もう一つの懸念材料は
試験管から人への応用の際の橋渡しとなる
マウスなどの動物の選択です。
・代謝機能(67)
・輸送効率(68-70)
・血清脂質量(71)
・循環器での付着物(72)
・臓器の大きさ、重量比(73-77)(Ref.(1)Fig.5b)
これらがそれぞれ異なるため
ここから得られた結果をどのように評価するか？
この事が課題となります。
Species- agnostic nanoparticle delivery screening(SANDS)
このシステムでは10種類以上のナノ粒子を
人遺伝子経変した肝臓の有無で比較評価します(78)。
-
人への臨床応用の為、必要な項目は以下です。
(1)効果再現性(輸送効率など)
(2)生産再現性
(3)用量範囲での安全性(許容できる副作用)
(4)オフターゲット許容性
(5)人への投与スケールでの量産性
(6)生体内で分解できる物質(蓄積しない)
これらが挙げられています。
(Ref.(1) Fig.6筆者改変)

//Cell-type-specific delivery system//ーー
細胞ではなく脂質、ポリマーナノ粒子を使った輸送システムも
細胞種特異的輸送系統の構想に含まれます。
従って、今まで投資されてきた資源、技術、治験は
このシステムの実現に貢献するものです。
組織ごとの輸送効率はナノ粒子の構造、構成比によって異なりますが、
各組織のへの輸送効率を決める要因は何なのか？
Cell-type-specific delivery systemで示している
各組織の細胞表面にある受容体との結合親和性は
輸送効率を決める要因の一つになるのか？
それが非常に大切な情報となります。
上述した情報からは
おそらく細胞種特異的に多く発現している受容体と
結合親和性の高い表面構造をナノ粒子に組み込めば
標的となる細胞種に対する輸送効率は高まると考えられます。
しかし、肝臓や腎臓など蓄積されやすい臓器に対して
どのようにその蓄積を回避するかという事も考える必要があります。
-
Cell-type-specific delivery systemでは
ナノ粒子の他にiPS細胞などの細胞をナノ粒子として
使う事も想定しています。
今まではナノ粒子そのものが選択対象でしたが
細胞種特異的輸送系統では
ナノ粒子に精密に設計されたタンパク質を装飾するため
そのたんぱく質の種類によっても分類されるか？
ということがあります。
つまり、臨床までのパイプラインの鍵となる
ナノ粒子の絞り込みがより複雑、その対象が多様となるか？
ということです。
もし、ナノ粒子と装飾タンパク質を特定した状態で
個別承認となれば、事前の試験管、動物実験において
より精密な絞り込みが必要になります。
そうなれば、アンカーさせる細胞種特異的な受容体に対する
基礎研究時点での選択が非常に重要になってきます。
-
Cell-type-specific delivery systemは
色んな段階があると思っています。
脂質ナノ粒子に抗体などを付着させるようなものもあれば
iPS細胞など幹細胞を使って、細胞種も決めて
合成生物学のアプローチを使って遺伝子的に
精密に表面タンパク質を発現させるものも考えられます。
後者は当然、製造プロセスが複雑で高価になります。
従って、それに見合う利点を提示する必要があります。

//まとめ//ーーー
新型コロナウィルスの脂質ナノ粒子を使ったmRNAワクチンが
数十億回数以上接種されたことで
今後、一気にナノ粒子を使ったRNA療法が
様々な疾患に対して臨床応用されていくと考えます。
ワクチンは健康な人への接種であり
より高い安全性が求められます。
従って、その判断基準は厳しいものでした。
これをよりリスクの高い感染症や疾患に応用するときには
リスクとベネフィットの天秤が変わってきます。
その時に新型コロナウィルスワクチンを実用化させた
軌跡、技術、経験、疫学データ、分析結果が役に立つと考えられます。
細胞種特異的輸送系統においても
このナノ粒子を使ったRNA療法との整合性は高く
マイルストーンに含まれ、その延長線上に実現があります。

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