複数抗原自発発光による乳癌組織の単一細胞レベル3次元画像解析

//背景//ーー
基礎研究、応用研究、臨床に至るまで
その水準を上げていくためには分析技術は欠かせません。
例えば、基礎研究において実験と分析は
双方で密接に関わりあうものです。
どんなに精巧な計算、シミュレーションをしたとしても
実環境において出力される結果には
予想外のものが含まれます。
従って、起こっている現象を正確に観察する、分析する事は
医療の発展においてとても重要になります。
臨床においても、今後、精密医療の発展に伴って
患者さんごとの遺伝子解析や
治療後の様々な検査、解析が必要になります。
ー
今述べた遺伝子解析は検体に対する
遺伝子コードの文字列の変換になります。
従って、どのようなたんぱく質、RNA、DNAがあるか？
というのを包括的に把握する事ができますが、
その空間的分布を把握する事は難しいです。
空間的分布を把握するためには
視覚化できる顕微鏡が必要になります。
その視覚化できる顕微鏡においては
低温電子顕微鏡のように原子レベル、結合レベルの
ナノオーダーレベルの非常に高解像度の結果が
得られる手法があります。
これはタンパク質の残基を含む構造レベルの
解析に広く使われています(2)。
このような原子レベルの分析から
細胞単位レベル、組織、臓器レベルまで
様々なスケールでの顕微鏡を使った視覚的解析手法があります。
ー
分子レベル、細胞レベルの分析の中において
免疫染色や色原体を使って、
細胞や受容体に結合した抗体を自発発光させることによって
空間的な分布をその光を検出する事によって把握する
という手法があります。
このImaging mass cytometry(IMC)は
多重送信によって40種類の抗原まで検出する事が可能です(3)。
しかしながら、今まで出力された像において
2次元から3次元に拡張することが困難でした。

//報告(1)//ーー
Laura Kuett, Raúl Catena(敬称略)ら医療研究グループは
多抗原による多重送信によるIMCにおいて
3次元に拡張した蛍光発光像を
単一細胞レベルの解像度で組織レベルのスケールにおいて
得られたことを報告しています(1)。
本日は、その内容の一部を引用させていただき
読者の方と情報共有したいと思います。

//検体(1)//ーー
Formalin-fixed  paraffin-embedded(FFPE)  
フォルマリン固定、パラフィン挿入組織
(参考文献(4))
ダイヤモンドナイフで
2μm区画での薄膜試料を作製。
(Fig.1a　1st-2nd process)

//スケール(1)//ーー
652×488×304μm^3

//分析組織(1)//ーー
HER2+管状乳癌(腺腫)
(Fig.1b)

//エピトープ(1)//ーー
CD68, CD8α, CD20, CD3（共通の免疫細胞マーカー）

//区画(1)//ーー
イリジウムチャンネル
単一細胞の視覚化(ランダムカラー)(Fig.2b,c)

//細胞レベル表現型(1)//ーー
上皮細胞 panCK  clusters 1–7, 10–13
間質細胞 SMA  clusters 17, 22
B細胞 CD8a, CD3, CD45 cluster 25
マクロファージ CD68, CD45 cluster 30
内皮細胞 vWF, CD31 cluster 21
(Fig.3b-d)

//間質、上皮、内皮、B細胞像(1)//ーー
黄色：上皮
青色：間質
赤色：内皮
白色：B細胞
(Fig.5d)

//乳癌細胞の浸潤(1)//ーー
間質の間に乳癌(HER2+)が浸潤。
紫色：間質細胞
青色：乳癌細胞
(Fig.6f　右)
癌細胞の中には、
細胞接合にかかわるカドヘリンが多く分泌。
黄色：E/P-cadherin
(Fig.6f　左)
癌細胞が大きく２つにわかれ、
周囲に単一細胞レベルで播種している様子がわかる。
白い点々。
(Fig.6f　左)

//乳癌細胞の癒着(1)//ーー
癌細胞が上皮細胞に癒着している様子
灰色：CK8/18 上皮細胞
紫色：HER2　乳癌細胞
(Fig.6c)
従って、癌微小環境の分析に利用できます。

//機械学習の余地(1)//ーー
画像解析は様々な意味で人工知能、機械学習、深層学習との
相性がよいと考えられます。
Laura Kuett氏らが言及しているように
正確な細胞の形や不鮮明な表現型の認識など
画像の解像度の向上に貢献できる可能性があります(1)。
ー
また例えば、画像の枚数を増やして
エピトープなどの何らかの基準を示して教師データを
作ることで個人の異種性を超えた何らかの傾向を掴むことが
できるかもしれません。
それによって限られたデータ、解像度の低いデータから
人工知能によって拡張した、高精細な組織予測が
それぞれできる可能性も否定はできません。

//Cell-type-specific delivery system//ーー
このような3次元解析は
乳癌を始めとした癌細胞に免疫機能がどのように働いているか？
という事も調べる事ができます。
一方、薬剤を作用させたときに
その薬剤の残渣、痕跡が何らかの形で組織内に残っていれば
薬剤がどのように働いているか？
例えば、癌細胞、その近傍、通常細胞に
どのように分布しているか？
このような事が分析できるかもしれません。
但し、その場合、蛍光発光で差別化できる信号を組み込む必要があります。
細胞種特異的輸送系統(Cell-type-specific delivery system)。
これの分析においても、
本当に組織内において特異的に作用しているか？
間質などによって阻止されていないか？
その解析において一つの鍵となる分析手法であると考えられます。
そのためには何らかの信号として差別化できる痕跡を
薬剤を組み込んだナノ粒子に組み込む必要があります。

(参考文献)
(1)
Laura Kuett, Raúl Catena, Alaz Özcan, Alex Plüss, Cancer Grand Challenges IMAXT Consortium, Peter Schraml, Holger Moch, Natalie de Souza & Bernd Bodenmiller 
Three-dimensional imaging mass cytometry for highly multiplexed molecular and cellular mapping of tissues and the tumor microenvironment
Nature Cancer (2021)
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Author information
Author notes
Marcel Burger, S. Tietscher & J. Windhager
Present address: Department of Quantitative Biomedicine, University of Zurich, Zurich, Switzerland
Alaz Özcan
Present address: Department of Immunology, University Hospital Zurich, University of Zurich, Zurich, Switzerland
Alex Plüss
Present address: Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, Zurich, Switzerland
These authors contributed equally Laura Kuett, Raúl Catena.
Affiliations
Department of Quantitative Biomedicine, University of Zurich, Zurich, Switzerland
Laura Kuett, Raúl Catena, Alaz Özcan, Alex Plüss, B. Bodenmiller, L. Kuett, Natalie de Souza & Bernd Bodenmiller
Institute of Molecular Health Sciences, ETH Zurich, Zürich, Switzerland
Laura Kuett, B. Bodenmiller, Marcel Burger, L. Kuett, S. Tietscher, J. Windhager & Bernd Bodenmiller
Leica Geosystems part of Hexagon, Heerbrugg, St. Gallen, Switzerland
Raúl Catena
Department of Pathology and Molecular Pathology, University Hospital Zurich, Zurich, Switzerland
Peter Schraml & Holger Moch
Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich, Zürich, Switzerland
Natalie de Souza
Cancer Research UK Cambridge Institute, Li Ka Shing Centre, University of Cambridge, Cambridge, UK
H. R. Ali, G. Battistoni, S. Balasubramanian, D. Bressan, M. Callari, I. G. Cannell, H. Casbolt, A. Fatemi, E. Fisher, W. Greenwood, G. J. Hannon, C. Jauset, T. Kovačević, M. Lee, G. Lerda, C. M. Mulvey, I. Nugent, M. Paez-Ribes, I. Pearsall, F. Qosaj, K. Sawicka, S. Tavaré, S. A. Wild & E. Williams
Institute of Astronomy, University of Cambridge, Cambridge, UK
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McGovern Institute, Departments of Biological Engineering and Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA
S. Alon, E. S. Boyden, Y. Cui, A. Emenari, D. Goodwin, E. D. Karagiannis, A. Sinha & A. T. Wassie
Department of Molecular Oncology, BC Cancer, part of the Provincial Health Services Authority, Vancouver, British Columbia, Canada
S. Aparicio, D. Lai, E. Laks, Y. Li, A. McPherson, C. H. O’Flanagan, A. J. Roth, T. Ruiz, S. P. Shah & A. Smith
Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada
S. Aparicio, D. Lai, E. Laks, A. McPherson, A. J. Roth & S. P. Shah
Department of Chemistry, University of Cambridge, Cambridge, UK
S. Balasubramanian & M. Lee
Súil Interactive Ltd, Dublin, UK
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Howard Hughes Medical Institute, Department of Physics and Department of Chemistry and Chemical Biology, Harvard University, Cambridge, MA, USA
J. Fan, H. Lee, L. A. Sepúlveda, C. Xia, P. Zheng & X. Zhuang
Department of Oncology and Ludwig Institute for Cancer Research, University of Lausanne, Lausanne, Switzerland
J. A. Joyce & S. S. Watson
Computational Oncology, Department of Epidemiology and Biostatistics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, USA
A. McPherson, S. P. Shah & I. Vázquez-García
Department of Computer Science, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada
A. J. Roth
New York Genome Center, New York, NY, USA
S. Tavaré
(2)
Julia F. Greiwe, Thomas C. R. Miller, Julia Locke, Fabrizio Martino, Steven Howell, Anne Schreiber, Andrea Nans, John F. X. Diffley & Alessandro Costa 
Structural mechanism for the selective phosphorylation of DNA-loaded MCM double hexamers by the Dbf4-dependent kinase
Nature Structural & Molecular Biology (2021)
(3)
Giesen, C. et al. 
Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. 
Nat. Methods 11, 417–422 (2014).
(4)
Catena, R., Montuenga, L. M. & Bodenmiller, B. 
Ruthenium counterstaining for imaging mass cytometry. 
J. Pathol. 244, 479–484 (2018).