フィブロネクチンの構造と機能

フィブロネクチンは遍在する、需要な細胞外マトリックスです。
脊柱動物の発現される高分子量の糖タンパク質です。
分子量は470-500kDaで(1)、一次構造の長さは60-70nmです。
この1次構造を基本単位として
二次構造（αヘリックスやβシート）
三次構造（ポリペプチドの全体的な三次元形状）
四次構造（二量体形成）　
これらが形成されます。
細胞のプロセスの制御因子であり、
組織や細胞外マトリックスの形態形成を維持するための
Scaffolding protein、つまり構造を力学的に支えるタンパク質です。
従って、臓器形成、血管形成、それらのリモデリング、
それらをより微視的な、細胞レベルで支える
細胞接着、移動にも関わります。
こうした発達の機序だけではなく、恒常性の維持にも関与します。
しかし、人の臓器形成におけるフィブロネクチンの役割は
おそらくはっきり理解されていません。
--
フィブロネクチンのサブタイプは
(1)血漿フィブロネクチン（plasma fibronectin、pFN）
　　血漿中を200 to 600μg/mL含まれています。
(2)細胞性フィブロネクチン（cellular fibronectin、cFN）
(3)胎児性フィブロネクチン（fetal fibronectin、fFN）
選択的スプライシング部位は
EDA（エクストラドメインA）:
存在する場合はEDA+、存在しない場合はEDA-。
EDB（エクストラドメインB）:
存在する場合はEDB+、存在しない場合はEDB-。
IIICS（IIICS領域）:
異なる複数のスプライシングバリアントが存在。
-
(A)N-terminal domain (FNⅠ1-9) 70kDa
(B)Central binding domain (FNⅢ1-9) 120kDa
(3)Heparin-binding domain (FNⅢ12-14)
-
フィブロネクチンは単位構造である
FNⅠ、FNⅡ、FNⅢ、これらが直列に繋がっており、
構造の90%以上を占めます(1)。
それぞれの単位構造が様々な向きを変えながら連結されています。
(参考文献(1) Fig.1)
残りの10%は固定的に構造化されない柔軟な構造を取ります。
フィブロネクチンは全体では470-500kDaの分子量を取ります。
サブユニットは235-250kDaでこの2量体構造を取ります。
それぞれのサブユニットは以下、数珠上に連結されます。
12 type I (FNI), two FNII, and 15-17 FNIII modules
(参考文献(1) Fig.1)
C-ターミナルユニット近傍でジスルフィド結合し、2量体化します。
このうちタイプⅢはドメインの挿入やアミノ酸数など
スプライシングの違いによって構造的に変化することができます。
タイプⅠフィブロネクチンは45アミノ酸数をとり
5つのらせん構造が非平行のβシートを取ります(AB and CDE)
これらの5つのらせん構造はジスルフィド結合で連結されます。
(参考文献(3) Figure.2B)
タイプⅡは60アミノ酸数で2つのβシートがあります。
このらせん構造間に長いループ構造があります。
タイプⅢは90アミノ酸数で7つの螺旋鋼構造のβサンドイッチ構造をとる
折り畳み構造です。タイプⅠのようにジスルフィド結合を持ちません。
タイプⅡ、タイプⅢは参考文献(3) Figure 2C,Dに示されています。
構造は(参考文献(1) Fig.1)にも示されています。
-
それぞれのフィブロネクチンが結合できるリガンドは
(1)血漿フィブロネクチン (Plasma Fibronectin, pFN)
血漿フィブロネクチンは血液中に存在し、以下のリガンドと結合します。
　フィブリン: 血液凝固過程で重要な役割を果たす。
　フィブリノーゲン: フィブリンの前駆体。
　コラーゲン: ECM の主要成分。
　ヘパリン: 硫酸化グリコサミノグリカン。
　インテグリン: 特にα5β1およびαvβ3インテグリン。
　その他のプロテオグリカン: グリコサミノグリカンを持つタンパク質。
(2)細胞性フィブロネクチン (Cellular Fibronectin, cFN)
細胞性フィブロネクチンはECMの一部であり、以下のリガンドと結合します。
 インテグリン: α5β1およびαvβ3インテグリン。
 コラーゲン: 特にI型、II型、III型コラーゲン。
 ヘパリンおよび他のグリコサミノグリカン: ECMの構造と機能に関与。
 フィブリン: 創傷治癒プロセスに関与。
 他の細胞接着分子: カドヘリンやセレクチンなど。
(3)胎児性フィブロネクチン (Fetal Fibronectin, fFN)
胎児性フィブロネクチンは妊娠中に特異的に存在し、以下のリガンドと結合します。
 インテグリン: 特にα5β1インテグリン。
 ヘパリン: 結合による細胞相互作用の調節。
 その他のECM成分: コラーゲン、プロテオグリカン。
--
それぞれのフィブロネクチンがどの細胞種と結合するか？
(1)血漿フィブロネクチン (Plasma Fibronectin, pFN)
 血小板: Integrin αIIbβ3 (GPIIb/IIIa)
 内皮細胞: Integrin α5β1, Integrin αvβ3
 線維芽細胞: Integrin α5β1, Integrin αvβ3
 マクロファージ: Integrin α5β1, Integrin αvβ3
 リンパ球: Integrin α4β1 (VLA-4)
(2)細胞性フィブロネクチン (Cellular Fibronectin, cFN)
 線維芽細胞: Integrin α5β1, Integrin αvβ3
 内皮細胞: Integrin α5β1, Integrin αvβ3
 平滑筋細胞: Integrin α5β1
 上皮細胞: Integrin α5β1, Integrin αvβ6
 神経細胞: Integrin α8β1
(3)胎児性フィブロネクチン (Fetal Fibronectin, fFN)
 栄養膜細胞: Integrin α5β1
 羊膜細胞: Integrin α5β1
 絨毛膜細胞: Integrin α5β1
 筋細胞: Integrin α5β1, Integrin αvβ3

(1)血漿フィブロネクチン(Ref.(1))
血漿フィブロネクチンは肝細胞から分泌されます。
細胞表面に結合する前にはコンパクトな3次元構造を取り、
血液中を流動しています。
コンパクトな構造では特に構造の大部分を占める
15単位直列に結合したタイプⅢフィブロネクチンが
直線ではなく、3次元的に折りたたまれた構造をとります。
静電引力、疎水性相互作用、水素結合、分子間力、二硫化結合などが関わります。
これらの折り畳み構造は細胞内の生成過程、
細胞外の循環器でタンパク質の折り畳み構造の決定因子の一つである
シャペロンが関与している可能性がありますが、
具体的な関与についてはこれからの研究が待たれます。
2番目、3番目のタイプⅢFNと12-14番目のタイプⅢFNの
広範囲な相互作用はモデル化されています(1)。
(参考文献(1) Fig.2)
血清中に含まれるほとんどの細胞(免疫細胞、内皮細胞など)
と細胞膜上に発現されるインテグリンを通じて結合します。
この3次元構造は可塑的で、
細胞と接着後、拡張された配座(Extended conformation)を取ります。
(Extended V-shape conformation)
静電引力が強くなる、pHが大きくなる(酸性になる)と
フィブロネクチンの拡散長は低下します。
フィブロネクチンが収縮された配座を取るのは
静電気的な引力が関与しているからです。
血液と同じ速度で流れる事ができる限界の粒子径
ストークス系は媒質(塩)の濃度によって変化します。
フィブロネクチンは血液中に通常はあまり存在してほしくない
細菌やウィルスの作用によって折りたたみ構造を変える可能性があります(1)。
これが具体的に血液中に含まれる免疫細胞の機能に
どのような影響を与える可能性があるか？
①オプソニン化(5)の効果低下:
 フィブロネクチンはオプソニンとして働き、病原体をコーティングしてマクロファージや好中球などの免疫細胞による認識と貪食を促進します。折り畳み構造の変化により、フィブロネクチンのオプソニン機能が低下すると、免疫細胞が病原体を効率的に認識・除去する能力が低下する可能性があります。
②補体経路(6)の活性化の変化:
 フィブロネクチンは補体経路の活性化にも関与しています。折り畳み構造の変化は補体の適切な活性化を妨げ、結果として補体依存性の病原体除去能力が低下する可能性があります。
③細胞外マトリックスとの相互作用の変化:
 フィブロネクチンは細胞外マトリックス（ECM）の主要な構成要素であり、細胞の接着、移動、成長に関与しています。折り畳み構造の変化により、免疫細胞のECMとの相互作用が変わり、炎症部位への移動や組織修復の効率が低下する可能性があります。
④サイトカイン分泌の調節異常:
 フィブロネクチンは免疫細胞からのサイトカイン分泌の調節にも影響を与えることがあります。折り畳み構造の変化はこの調節機能に影響を及ぼし、免疫応答のバランスが崩れる可能性があります。
⑤抗原提示機能の低下:
 フィブロネクチンは抗原提示細胞（APC）において抗原の提示効率を高める役割を持つことがあります。折り畳み構造の変化が抗原提示の効率を低下させると、T細胞の活性化が遅延し、全体的な免疫応答が弱まる可能性があります。
但し、こうしたエビデンスは十分にある状況ではないので推定です。
--
細胞外マトリックスの身体における重要な役目は
①組織の構造的支持(機械的支持)
②細胞との結合による信号伝達
③組織の修復と再生
④組織の保護
⑤力の伝達
これらが挙げられます。
フィブロネクチンの特徴は構造の柔軟性があります。
つまり、非常に複雑な折り畳み構造を取ることができます。
これはビーズ、数珠のような構造を取り、いくつもの節を持つからです。
こうした配座の柔軟性は
即時的に形成する細胞の適切な足場に関与するため、
組織が損傷を負った時の細胞連結や組織形成に関わるため
③の組織の修復と再生に関わります。
また、フィブロネクチンは直線に伸ばした状況では
節があるため、引っ張りに対する構造的な強さはありませんが、
折り畳み構造を取るため、力をうまく分散する働きがあります。
一方で、フィブロネクチンと複合体を形成するコラーゲンは
3重螺旋構造で剛性が強い特性を持ちます。
つまり、機械的ストレスに対して強く構造が壊れないという特徴があります。
これは直線的な構造においてもそうです。
しかし、コラーゲンは構造的な柔軟性がないため
機械的な支持がなければ、折り畳み構造を取ることができません。
フィブロネクチンは折り畳み構造によって
コラーゲンを巻き込み、複合体を形成する事で
コラーゲンの剛性を付加することができます。
これによってあらゆる方向に対する構造的な強さを手に入れます。
こうした特性は常に強い付加がかかる
骨格筋、心臓、肺、血管などにおいて非常に重要です。
これらの機械的な強さが細胞-細胞間にかかる力を緩和するからです。
細胞はほとんどが水で出来ているため、
そうした支持がなければ、細胞骨格があるにしろ
容易に変形してしまうため、外側からの強い支持構造は大切です。
それは特に上述した動性の強い組織では顕著です。
こうしたコラーゲンとフィブロネクチンの複合体は
原理的に細胞間の密着結合、接着結合、接着斑などを守る働きが
あると考えられます。
強い細胞外マトリックスによって変形が減るため、
安定的なメカノトランスダクション信号伝達が可能になり、
逸脱した過剰な、過少な信号伝達を防ぐ働きもあります。
例えば、肺にはエラスチンが大量に含まれています。
これは肺が呼吸に応じて体積を変える必要があるからです。
エラスチンは伸縮性に富んだ細胞外マトリックスです。
確かに剛性が高いと体積を変えるために大きな力が必要になるため、
コラーゲンなどの剛性の高い細胞外マトリックスの密度と
3次元構成は様々なバランスの元、最適化されていると思います。
--
血漿フィブロネクチンはフィブリン塊に取り込まれ
結合、分散、凝集を含めて主に血小板の機能に貢献します。
FNⅠ1-5, FNⅠ10-12のドメインがフィブリンと相互作用します。

(2)細胞フィブロネクチン(Cellular fibronectin)(Ref.(8))
細胞性フィブロネクチンと血漿フィブロネクチンの違いは
生成さされる細胞種が血漿フィブロネクチンのように肝細胞ではなく
多くの細胞種
（線維芽細胞、内皮細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、筋細胞など(9)）から発現され、
血漿フィブロネクチンは可溶性が高く、血流に分布する一方で、
細胞性フィブロネクチンは組織常在性が高く、
細胞外マトリックスに高い結合性を持って取り込まれることがあります。
細胞性フィブロネクチンは選択的スプライシングを取り、
組織依存的、時間依存的(11)(つまり、その時に応じて変わる)、
細胞種特異的(10)に異なるアイソフォームを発現します。
従って、こうしたアイソフォームを
空間プロテオーム解析によって
組織、時間、細胞種とどういった組み合わせで発現されているかを
明らかにすることは私の系統的技術で重要になります。
少なくとも20の異なるフィブロネクチンアイソフォームが生成されています(12)。
例えば、FNⅢのループ構造の縁か、細胞シグナル、
FN-FN相互作用に影響を与える可能性があります(13)。
こうしたFN-FNの相互作用はアイソフォームの影響を受けるので、
フィブロネクチンを介した細胞外マトリックスの形成は
アイソフォーム特異的である可能性があります(8)。
フィブロネクチンのmRNAの発現量に
細胞種特異的に影響を与える制御因子は以下です。
(FN mRNAの発現を亢進)
TGF-β family
Pletelet-derived growth factor BB
Insulin-like growth factor-1
Hepatocyte growth factor
Glucose
Glucocorticoids
(FN mRNAの発現を抑制)
Cell contractility inhibitor
RhoA inhibitors
(参考文献(8) Table 3)
細胞種特異的なフィブロネクチンの特異的に結合性が変わる結合サイトを見つければ、
細胞外小胞などの薬物送達キャリアの細胞種特異的な送達のための
標的細胞種周辺の足場、ホッピング伝導のための動線として
利用できる可能性があります。
-
細胞フィブロネクチンの機能は
〇細胞接着、増殖、移動
〇細胞外マトリックスの蓄積
コーラゲン、フィブリリン、フィブリン、ラミニン、テナシンと結合します。
〇成長因子保持
細胞フィブロネクチンは成長因子に結合する能力があります。
血管内皮成長因子(VEGF)、フォーミング成長因子ベータ（TGF-β）などです。
局所濃度を調整し、成長因子が制御された形で作用するための
細胞への供給濃度、タイミングを調整します。
こうした局所的な保持によって成長因子が分解されることも防ぎます。
血管内皮成長因子の保持にも関わるので
新たな血管生成にも関与します(14)。
フォーミング成長因子ベータ（TGF-β）では筋線維芽細胞の分化に関与します。
--
線維化は細胞外マトリックスの過剰な蓄積によって特徴づけられます。
これにより臓器の構造や機能に障害が出ます。
こうした線維化が生じた時の細胞外マトリックスの
構成要素の主なものはコラーゲンですが、
コラーゲン自体が直線性の強い細胞外マトリックスなので
それに先立って、構造的に柔軟な
フィブロネクチンの過剰な蓄積があるとされています(8)。

(3)胎児性フィブロネクチン（ Fetal fibronectin、fFN）
胎児細胞が合成するフィブロネクチン（タンパク質）であります。
絨毛膜（chorion）と脱落膜（decidua）の間に存在し、
胎嚢(胎児の入っている袋)を子宮内膜に接着させる
「のり」の役目を果たしています。
従って、破水に密接に関わっており、
早期破水は早産のリスクを高めるので、
この胎児性フィブロネクチンは早期破水のバイオマーカーになっています(15)。


(参考文献)
(1)
Lisa M. Maurer, Wenjiang Ma, and Deane F. Mosher*
Dynamic Structure of Plasma Fibronectin
Crit Rev Biochem Mol Biol. 2015 Jul-Aug; 51(4): 213–227.
(2)
Xiangyi Gan, Lariza Ramesh, Nidhi Nair & Ananthalakshmy Sundararaman
Fibronectin Fibrillogenesis During Angiogenesis
Matrix Pathobiology and Angiogenesis pp 1–27
(3)
Nicole Catherine Norris
Structural and functional studies of intrinscally disorderd fibronectin-binding proteins
University of York Department of Biology August 2009
(4)
Helen Saibil
Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation
Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 14, pages630–642 (2013)
(5)
T K Hathaway 1, J L Adams
Plasma fibronectin: a third opsonic protein involved in immune clearance and destruction of erythrocytes after infusion of incompatible blood
Transplant Proc. 1988 Dec;20(6):1096-102.
(6)
G. BAATRUP, S.-E. SVEHAG
Serum and Plasma Fibronectin Binds to Complement Reacted Immune Complexes Primarily via C1q
Scandinavial journal of immunology vol.24 issue.5 p.583-590 (1986)
(7)
Sarah McCurdy,1 Catalin F. Baicu,3 Stephane Heymans,2 and Amy D. Bradshaw3
Cardiac Extracellular Matrix Remodeling: Fibrillar Collagens and Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine (SPARC)
J Mol Cell Cardiol. 2010 Mar; 48(3): 544–549.
(8)
Wing S To & Kim S Midwood
Plasma and cellular fibronectin: distinct and independent functions during tissue repair
Fibrogenesis & Tissue Repair volume 4, Article number: 21 (2011) 
(9)
Yong Mao 1, Jean E Schwarzbauer
Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process
Matrix Biol. 2005 Sep;24(6):389-99. 
(10)
R P Hershberger and L A Culp
Cell-type-specific expression of alternatively spliced human fibronectin IIICS mRNAs.
Mol Cell Biol. 1990 Feb; 10(2): 662–671.
(11)
A L Gehris 1, S A Oberlender, K J Shepley, R S Tuan, V D Bennett
Fibronectin mRNA alternative splicing is temporally and spatially regulated during chondrogenesis in vivo and in vitro
Dev Dyn. 1996 Jun;206(2):219-30.
(12)
C ffrench-Constant 1
Alternative splicing of fibronectin--many different proteins but few different functions
Exp Cell Res. 1995 Dec;221(2):261-71
(13)
Elisa Ventura 1, Francesca Sassi, Arianna Parodi, Enrica Balza, Laura Borsi, Patrizia Castellani, Barbara Carnemolla, Luciano Zardi
Alternative splicing of the angiogenesis associated extra-domain B of fibronectin regulates the accessibility of the B-C loop of the type III repeat 8
PLoS One. 2010 Feb 10;5(2):e9145.
(14)
Xiaoming Zhou,1,6 R. Grant Rowe,1,6 Nobuaki Hiraoka,1 Jerry P. George,2 Denis Wirtz,2 Deane F. Mosher,3 Ismo Virtanen,4 Michael A. Chernousov,5 and Stephen J. Weiss1
Fibronectin fibrillogenesis regulates three-dimensional neovessel formation
Genes Dev. 2008 May 1; 22(9): 1231–1243.
(15)
Ibrahim A Abdelazim
Fetal fibronectin (Quick Check fFN test(®)) for detection of premature rupture of fetal membranes
Arch Gynecol Obstet. 2013 Feb;287(2):205-10.