エクソソームの生物発生機序と小児脳腫瘍治療への応用

エクソソームを薬物送達媒体として利用するためには
iPS細胞技術によって精製した神経細胞から
エクソソームを抽出する際に
神経細胞内でのエクソソーム内に入る
物質を巧みに制御する必要があります。
言い換えれば、不必要な物質が挿入されるのを抑制する必要があります。
分泌されてから、内腔にある物質を取り出し、
再度挿入するというのは高い技術が必要ですし、
工数、コストの増加にもつながるので
できるだけそうしたプロセスがいらないように
細胞内のカーゴ機序を正確につかんで
分泌時点で、内包物の任意選択性を獲得しておくことが重要です。

細胞外小胞は細胞間のコミュニケーションとしての役割があります。
細胞は決して独立して存在しているわけではなく、
周りの細胞と協調しあいながら、恒常性を保っています。
細胞外小胞は分泌遊離物質とは異なり、
膜で内容物が保護され、細胞内外への移動性を持ちますから、
特に離れた細胞同士の機能の連携に寄与すると考えられます。
当然、内容物によって機能の伝達が行われるので
細胞内で細胞外小胞前駆体が生成される段階で、
どういった内容物を入れるかは機能の連携に関わるので重要です。

Andrew C. Dixson(敬称略)らの総括のTable 1を参照すると
細胞外小胞内にどういった物質が輸送されるかは
元々、細胞膜(小胞膜)、膜発現物質との親和性が高い物質が
ソーティングエフェクターとなって
内容物を引き込むと考えられますが、
それらには結合性に応じた組み合わせがあると考えられます(1)。
そのTable 1について以下にまとめます。
(左：Sorting effector ⇔ 右：Cargo)
HRS ⇔ PD-L1
TSG101 ⇔ CD63, MHC-II
ARRDC1 ⇔ TSG101, NOTCH2
CD9 ⇔ CD10, β-Catenin
CD63 ⇔ PMEL17, LMP1
CD81 ⇔ RAC
CD82 ⇔ β-Catenin, Ezrin
Syntenin ⇔ CD63, Syndecan 1, Lysyl-tRNA synthetase
Syndecan 1 ⇔ β Integrin, Fibronectin
ALIX ⇔ Syntenin, PAR1, PD-L1
ARF6 ⇔ MHC-I, Pre-miRNA, Exportin 5, Dicer, AGO2
VPS4, CHMP4 ⇔ β-Catenin
Caveolin 1 ⇔ Sortillin
hnRNPA1, caveolin 1 ⇔ miR-27a-3p, miR-27b-3p, miR-92a-3p, miR-221-3p, miR-21
hnRNPA2B1 ⇔ miR-198, miR-601, miR-451, miR-575, miR-125a-3p, miR-887, miR-17, miR-93, miR-122-5p,H19 lncRNA,AGAP2-AS1 lncRNA, AFAP1-AS1 lncRNA
(その他、Table 1参照)
例えば、hnRNPA2B1は多くのmiRNAのエスコート(同伴者)役として
細胞外小胞内に誘導するわけですが、
Carolina Villarroya-Beltri(敬称略)らがFigure 6に示すように(2)
hnRNPA2B1とmiRNAに結合性があるからエフェクターとして働きます。
こうした場合、hnRNPA2B1も細胞外小胞内に入るために
脂質膜や脂質膜発現タンパク質などと結合性を有していると推定されます。
これは小嶋  良輔(敬称略)らが図1で示すように(3)
特定の物質が細胞外小胞(前駆体)にカーゴされるためには
膜や膜の物質と直接的に結合性を持つ物質と複合体化する必要があり、
そうしたエフェクターはエスコート役として
膜貫通、膜結合、膜装飾物質結合性を有している事が想定されます。
但し、それ以外の物質的、エネルギー的誘導機序はあるかもしれません。
少なくとも私が
ARF6 ⇔ MHC-I, Pre-miRNA, Exportin 5, Dicer, AGO2
これらの関連性について評価したところ、
これらの結合性については明らかではありませんが、
少なくともARF6、MHC-Iが同時に高濃度で
細胞外小胞(前駆体)内に存在してきた事は確認されています(4)。
他方で、
Syndecan 1 ⇔ β Integrin, Fibronectinの組み合わせがありますが、
インテグリンとシンデカンは共に細胞接着分子で
共に膜貫通形質を有します。
従って、細胞外小胞前駆体に収納されるときの
主従関係がどうなっているかははっきりとはわかりません。
すなわち、βインテグリンの方が
逆にシンデカン1を小胞内に誘導している可能性もあるのではないか？
ということです。

エクソソームの表面を細胞内経路を利用して
バイオエンジニアリングする上で
実際にどのような経路をたどってエクソソームの膜に
膜貫通タンパク質が形成されるかを理解する事は重要です。
細胞膜、エンドソーム、
multivesiclar body、
intraluminal vesicles(エクソソーム前駆体)
これらの膜は連携しています。
基本的に細胞膜が曲げられて、陥入して
エンドソームが形成されるときに、
細胞膜が曲げられるためには機械的特性の揺らぎが重要です。
そうしないと物理的、機械的に波打たないからです。
膜の機械的特性を大きく変えるのは
密にパッキングされている飽和脂質、コレステロールです。
この飽和脂質が細胞膜上で流動性を持ち、
局在化した、集まった状態を脂質ラフトと呼びます。
この脂質ラフトの部分に
テトラスパニンなど細胞膜貫通タンパク質が集まる傾向にあるので
細胞膜上にある膜貫通タンパク質は
そのままエンドソームの膜に引き継がれることになります。
こうした物理はおそらくある程度共通で、
multivesiclar bodyからintraluminal vesiclesが
形成されるときも同様です。
これは「ESCRT-independent」Exosome pathwayと定義されます(5)。
(参考文献(5) Fig.1)
従って、私が定義する細胞接着分子は
全て細胞膜上に発現する性質を持っていますから、
その細胞接着分子をエクソソーム上に発現させる事は
特にエスコート(同伴)なしでも原理的に可能なはずです。
一方で、
ESCRTsは4つのサブタイプがありますが、
それらが複合体化して、ダンゴムシのようにつらなり、
それをレールとして内腔に独立的に存在する
カーゴや膜貫通タンパク質をエクソソーム前駆体に誘導します。
このESCRT(Ⅲ）は
Jun Arii(敬称略)らがFig.10bに示すように(6)
budding(萌芽)した膜が
小胞となるプロセスで膜を閉じて、丸くする、閉経路を作るうえで
おそらく重要な役割を果たします。
首の部分の負の曲率を検知するとあります(1,9)。
従って、特に細かい小胞を作るときに、
必ずしも確率的にbuddingした細胞膜が小胞として閉経路を
形成しない場合もあると仮定すると、
ESCRTは出口側で細胞膜の間に挟まって、
小胞を閉じるプロセスに関わっているため、
その確率を上げる可能性があります。
従って、このESCRTと安定した結合性を持つように
細胞接着分子を遺伝子的にデザインすると
その細胞接着分子のエクソソームへの細胞膜上の表現が
高められる可能性があります。
逆に言えば、装飾を抑制したい分子は
細胞内の絶対量を減らす事も一つですが、
このESCRTとの結合性を特異的に下げる事ができれば、
実現する可能性があります。
また、ESCRTに依存する物質を入れたくないときには
エクソソームの生成が妨げられる可能性はありますが、
ESCRTの発現を抑制すれば、
非依存的な機序を持つ物質に限定できる可能性もあります。

一方で、Rab27bと呼ばれるエクソソームの分泌に関わるたんぱく質があります。
これはエクソソーム前駆体を多く封入した
multivesiclar bodyが細胞膜と融合するのに関わります。
それによって内腔が開放され、エクソソームが放出されます。
このRab27bが抑えられるとエクソソームの分泌は抑えられます。
(参考文献(7) Fig.7)
それがエクソソームの分泌が多い癌細胞で確かめられています(8)。
もし、私の仮説が当てはまり、
ESCRTがMVB内のエクソソーム数に関連があるとすると、
RaB27bとESCRT両方の発現を押さえれば、
エクソソームの分泌をより強力に抑制できる可能性があります。
Ningqiang Gong(敬称略)らの報告によると
癌細胞からのエクソソームの分泌を抑える事で
ナノ粒子の薬物送達効率が上がる事が示されていますが、
これは、遊離薬剤でもある程度当てはまるかもしれません。
当然、エクソソームでもそうなる可能性があります。
癌細胞の他の細胞との異常な連携性を絶つという意味でも有効ですから、
エクソソームをより強力に抑える事ができれば、
薬物送達も含めて、癌の治療に役立つ可能性があります。

エクソソームの径、大きさが何で決まっているかという事を
理解する事は非常に重要ですが、
脂質膜構成、装飾物質など複雑に関わっていて
現時点では何が決定因子かはわかっていません。
少なくとも膜が盛り上がる膜長さが
おおよそのエクソソームの外周になると考えられますが、
その長さが必ずしも連続した脂質ラフトと一致するかも
疑わしい部分があります。
脂質ラフトは1nm-200nmまでの長さを取ると言われていますが、
かりに200nmとしても、
そこから計算されるエクソソームの直径は約60nmにしかならないため
観測されるエクソソームの150、200nmといった径には届きません。
一定の矛盾があります。
ただ、このILVの形成はスフィンゴ脂質のセラミドが
引き金を引いていると報告されています(10)。

エクソソームがどれくらいの大きさがいいか？
これは実験してみないとわからない領域は必ず存在しますが、
特に脳腫瘍、脳神経系の治療を想定した時には
血液脳関門が通常組織よりも強いバリアになる事には変わりありませんから、
(病変部位に送達するときに必ず超える必要があるかという
前提を問う余地はあるものの)
それを有効に超えられる大きさが良くて、
普通に考えると小さい方が良いという事になります。
ただ、小さいと中に入れられる物質の分子量の制限は出ます。
今、仮に最も小さな30nmを目指すとすると
外周の長さがだいたい100nmくらいになりますから、
それくらいの膜領域をbuddingさせたいということがあります。
力のバランスから考えると
小さい径のほうが大きな力を必要とします。
脂質2重層のinwardなので内側を強く引っ張る力です。
Harvey T. McMahon(敬称略)らは
一般的な脂質膜の曲率について総括されています(11)。
(MC1)脂質膜に円錐の物質が入ることで曲げられる
(MC2)2重層の片側に物質が挿入される
(MC3)細胞骨格からの力
(MC4)周囲を覆う高分子構造(曲率の安定)
(MC5)膜貫通タンパク質の構造変化
これらの要素があるのですが
状況証拠から考えて
エクソソームの径の決定因子の一つは
おそらく膜貫通タンパク質の構造変化によるものが大きいと思います。
特に小さい径のものは、高い曲率が必要なので、
より大きな非対称性力学が必要になります。
Harvey T. McMahon(敬称略)らは
小さな曲率の為にはタンパク質の疎水性相互作用のような
ダイナミックな折り畳み機序が必要だと言われています(11)。
こうした配座の変化で曲率を与える一つのタンパク質は
おそらくテトラスパニンです。
(参考文献(12) Fig.1)
Open配座が必ずしも高い曲率を実現するかは
まだ高いエビデンスレベルにはありませんし、
Open AIはテトラスパニンが多くなると径が大きくなる
と回答したので、はっきりはわかりませんが、
状況証拠として条件を掴むという事は重要かもしれません。
すなわち
例えば、神経細胞から分泌されるエクソソームを分析するときに
目的とする大きさのエクソソームを詳細に分析することです。
◎脂質膜構成
◎テトラスパニンの密度、サブタイプ
◎インテグリンなど他の膜貫通タンパク質の密度、サブタイプ
一つ一つの構造をエクソソームを分泌する
細胞種を固定した状態で任意の大きさで分析すると
一定の傾向が見えるかもしれません。
そうしたらそれを元により確定的な物理モデルを立てられるので
例えば、30nmのエクソソームをより多く分泌させる
条件を見つける事に貢献するかもしれないし、
エンジニアリングによって
もっと小さなエクソソームを分泌できるようになるかもしれません。
ただ、脂質膜の厚さから曲げられる限界の曲率があり、
それがすでに30nm程度なのかもしれません。
径の小さいエクソソームの形成には
Tetraspanin-enriched microdomainsが関係している可能性があります。
その為にはテトラスパニンとインテグリンなど
他の膜貫通タンパク質の共通のアダプタータンパク質を
見つける必要があります。
その役割を果たすのがSyntenin-1です(49,50)。
(参考文献(51)　Figure 2 )
従って、共通のアダプタータンパク質Syntenin-1や
受容体を集めるクラスリン、ESCRT0の機能を高めることで
より小さい径のエクソソームを多く生み出せる可能性があります。
ただし、これは実験してみないとわかりません。
Syntenin-1はPDZドメインを持つ足場タンパク質なので
他の細胞接着分子と広範に結合する能力を有します。


このテトラスパニンのうちCD63は
エクソソーム前駆地(ILV)の生成に関わっていて
これをsiRNAでノックダウンすると
ILVの数が顕著に減少しています。
(参考文献(13) Figure 2)

例えば、エンドサイトーシスする時のエンドソームの胞の径は
250nm～1000nmとエクソソームよりも大きく、
その径、曲性を安定的に保つために
周辺がクラスリンなどでコートされることもありますが、
径の小さなエクソソームではおそらくその曲性は
膜貫通タンパク質によって支えられています。
上述したように径の小さな胞は高い曲率を実現するために
胞の外側の膜を強く引っ張る必要があります。
その力を得るためには
タンパク質の3次元構造の変化のような
動性の高い変化に応じた強い力が必要です。
テトラスパニンがClose配座からOpen配座に
脂質ラフトなどの環境によって変わる事があとしたら、
それが膜の曲性に貢献している可能性がありますが、
そうした配座の変化とエクソソームの生成については
よくわかっていません。
しかし、膜が曲がっている部分に
テトラスパニン複合体が集中していることは
既に確認されています.
(参考文献(14) Fig.6)
従って、テトラスパニン複合体がエクソソームの径の
一つの重要な決定因子になっている可能性はあります。

miRNAはLuca F. R. Gebert(敬称略)らがFig.1に示すように(15)
mRNAに結合してmRNAの分解速度を変えたり、
転写開始位置にタンパク質を結合させる事で
転写を抑制したりする機序があります。
これによって特定の遺伝子発現が調整されます。
エクソソームは
hnRNPA1, caveolin 1
hnRNPA2B
YBX1
FMRP
SYNCRIP
hnRNPU
MEX3C–AP2
La protein
これらの物質がそれぞれ特異的なmiRNAをエクソソームに
ソーティングエフェクターとして誘導します。
(参考文献(1) Table 1)
このようなmiRNAを使った遺伝子的治療は
エクソソームを薬物送達媒体として利用するときの
一つの中心的なモダリティーです。
例えば
(GT1)miR-124(16,17)
実際に全てのグレードの膠芽腫で例えばmiR-124発現が弱まっています(18)。
また、子どもで頻発するMedulloblastomaの成長も抑制します(25)
(GT2)miR-128(19-21)
(GT3)miR-34a(20,22)
(GT4)miR-7(23,24)

では上述したmicroRNAはどのタンパク質発現を抑制するか？
これを確認する事は治療の上で重要です。

(GT1)miR-124
◎CDK6
  サイクリン依存性キナーゼ6（CDK6）は細胞周期の進行を促進します。
  miR-124はCDK6を抑制することで細胞増殖を抑えます(26)。
  このCKD6はCKD4と共に癌ではユビキタス(遍在する)メカニズムです(27)
◎STAT3
　シグナル伝達および転写活性化因子3（STAT3）は
　細胞増殖、分化、アポトーシスに関与します。
　miR-124はSTAT3の発現を抑制し(28)、
　腫瘍細胞の増殖と生存を阻害します。
  これの持続的な活性は多様な人の癌において
　増殖、生存、血管生成、転移を促進し、
　一方で、抗癌免疫機能も抑制します(29)。
◎SLC16A1（MCT1）:
　モノカルボン酸トランスポーター1（MCT1）は
　腫瘍細胞のエネルギー供給に関与します。
　miR-124はMCT1を抑制し、腫瘍細胞の代謝を阻害します。

(GT2)miR-128
◎Bmi-1
　B細胞特異的モロニー白血病
　ウイルスインテグレーション部位1（Bmi-1）は、
　細胞周期と自己複製に関与する
　ポリコームリプレッサー複合体1のメンバーです。
　miR-128はBmi-1を抑制することで(30)、
　腫瘍細胞の自己複製と増殖を抑えます(31)。
◎E2F3a　
　E2F転写因子3a（E2F3a）は
　細胞周期のG1/S移行を制御し、細胞増殖に関与します。
　miR-128はE2F3aの発現を抑制し、細胞周期の進行を阻害します。
◎Reelin
　神経発生に関与する細胞外マトリックス糖タンパク質で、
　グリオーマの浸潤と腫瘍進行に関与します。
　miR-128はReelinの発現を抑制し、腫瘍の進行を抑えます(32)。
　このReelinは膠芽腫において移動性に関わっている可能性があります(33)。

(GT3)miR-34a
◎Notch1
　Notchシグナル伝達経路は細胞の分化、
　増殖、およびアポトーシスに関与します。
　miR-34aはNotch1を抑制し(34)、
　腫瘍細胞の増殖と自己複製を阻害します。
  Nptchシグナルは組織形成に関わります。
　この過剰発現は、腫瘍組織の促進に関与します(35)。
◎Bcl-2
　アポトーシス阻害タンパク質Bcl-2は、
　細胞の生存を促進します。
　miR-34aはBcl-2を抑制し(36)、
　アポトーシスを誘導します。
  従って、Bcl-2を抑制する事は
　癌細胞の細胞死抑制機序を緩和し、細胞死に向かわせます(37)。
◎CDK6　
　CDK6の抑制は細胞周期の停止と増殖の抑制に寄与します。
　miR-34aはCDK6を抑制し(38)、細胞周期を停止させます。

(GT4)miR-7
◎EGFR
　上皮成長因子受容体（EGFR）は
　腫瘍細胞の増殖と生存を促進します。
　miR-7はEGFRの発現を抑制し(39)、腫瘍の増殖を阻害します。
  特に肺がんとの関連性が指摘されています(40)。
　medulloblastomas（小児脳腫瘍）では
　EGFRファミリーであるc-erbB-2 (HER-2) が70%で陽性でした(41)。
  EGFGの遺伝子発現の上昇、制御不全は
　膠芽腫の進行性に関与します(43)。
◎IRS-2
　インスリン受容体基質2（IRS-2）は、
　増殖シグナル伝達経路の活性化に関与します。
　miR-7はIRS-2を抑制し、腫瘍細胞の増殖を阻害します。
◎RAF1
　RAF1はMAPキナーゼ/ERK経路に関与し、
　細胞増殖と生存を促進します。
　iR-7はRAF1を抑制し(42)、細胞の増殖と浸潤を阻害します。

実際に癌細胞ではエクソソームの分泌が多くなることが知られています。
健康な人との血液中の比較では
癌に罹患している患者さんではその量が2倍以上でした(44,45)。
これはおそらくいくつかの要因が関連しています。
癌微小環境では一般的に低酸素状態になります。
これがテトラスパニンの発現を高める結果となります(44)。
実際にDongsic Choi(敬称略)らの
膠芽腫の細胞外小胞のプロテオーム解析でも
2つのサブタイプのテトラスパニンとインテグリンβ4の発現が
顕著に亢進しています
(参考文献(43) Fig.2A)
Rie Umeda(敬称略)らの研究で
テトラスパニンとインテグリンの複合体などが
エクソソームの形成に関係していると推測されることから
それらの発現が顕著に亢進されると、
1つのMVBあたりのエクソソーム数が増えると考えられます。
また、癌組織では一般的にレプチン/レプチン受容体が亢進されます(46)。
このレプチンシグナルはエンドソーム/MVBsを増やす働きがあるため
その中に複数個形成されるエクソソームもその数に応じて、
生物発生数が増え、結果、多く分泌されることに利ます。
(参考文献(1) Fig.3f)

血管中のエクソソームが増える事は
特に小さいエクソソームを薬剤キャリアとして
全身投与で入れる場合、
こうした血管中のエクソソームと干渉、結合して
肝臓で代謝されやすくなり、
薬物送達効率が低下してしまう可能性があります。
従って、癌細胞からのエクソソーム量を
◎テトラスパニンの抑制
◎ESCRTの抑制
◎Rab27の抑制
◎レプチン受容体の抑制
◎インテグリンの抑制
◎Rubiconの抑制？(52,53)
これらなどで減らす事は重要かもしれません(8)。
一方で、
薬物送達キャリアのエクソソームをより強力なキャリアである
循環器に豊富に存在する血小板、赤血球(47)
さらに癌向性がある免疫細胞と複合体化して、
それらに病変部位まで誘導してもらう事で
それらは細胞であり、エクソソームより質量が大きいですから
エクソソーム単体よりも
癌細胞由来のエクソソームとの
干渉の効果は減らせる可能性があります。

エクソソーム生成過程では
低酸素、酸化ストレスなどよりグローバルな条件から
レプチンシグナル、カルシウムシグナル(48)など
特定のシグナルを誘導する事で
エクソソームの分泌やカーゴが変化する事があります。
従って、
エクソソームを薬物送達キャリとして
細胞内で自然に生物発生させるときには
生物発生させるときの環境因子を最適化して、
それをできるだけ細かい因子も含めて固定して、
そのシグナルの元になる受容体構造、発現は
ドナー細胞生成の段階から適正に最適化、管理する事が大切になります。
これはiPS細胞技術なら人為的に分化培地を変えられるので
こうした制御と管理はできると推定しています。



(参考文献)
(1)
Andrew C. Dixson, T. Renee Dawson, Dolores Di Vizio & Alissa M. Weaver
Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection
Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 24, pages454–476 (2023)
(2)
Carolina Villarroya-Beltri, Cristina Gutiérrez-Vázquez, Fátima Sánchez-Cabo, Daniel Pérez-Hernández, Jesús Vázquez, Noa Martin-Cofreces, Dannys Jorge Martinez-Herrera, Alberto Pascual-Montano, María Mittelbrunn & Francisco Sánchez-Madrid
Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs
Nature Communications volume 4, Article number: 2980 (2013)
(3)
小嶋  良輔，國武  厚貴
合成生物学的アプローチが可能とする 細胞外小胞の理解と発展的利用
生化学  第 95 巻第 2 号，pp. 194‒200（2023）
(4)
Vandhana Muralidharan-Chari 1, James Clancy, Carolyn Plou, Maryse Romao, Philippe Chavrier, Graca Raposo, Crislyn D'Souza-Schorey
ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles
Curr Biol. 2009 Dec 1;19(22):1875-85. 
(5)
Candia M. Kenific, Haiying Zhang & David Lyden
An exosome pathway without an ESCRT
Cell Research volume 31, pages105–106 (2021)
(6)
Jun Arii, Mizuki Watanabe, Fumio Maeda, Noriko Tokai-Nishizumi, Takahiro Chihara, Masayuki Miura, Yuhei Maruzuru, Naoto Koyanagi, Akihisa Kato & Yasushi Kawaguchi 
ESCRT-III mediates budding across the inner nuclear membrane and regulates its integrity
Nature Communications volume 9, Article number: 3379 (2018) 
(7)
Lin Song, Shi Tang, Xiaolei Han, Ziying Jiang, Lingling Dong, Cuicui Liu, Xiaoyan Liang, Jixin Dong, Chengxuan Qiu, Yongxiang Wang & Yifeng Du
KIBRA controls exosome secretion via inhibiting the proteasomal degradation of Rab27a
Nature Communications volume 10, Article number: 1639 (2019) 
(8)
Ningqiang Gong, Wenqun Zhong, Mohamad-Gabriel Alameh, Xuexiang Han, Lulu Xue, Rakan El-Mayta, Gan Zhao, Andrew E. Vaughan, Zhiyuan Qin, Fengyuan Xu, Alex G. Hamilton, Dongyoon Kim, Junchao Xu, Junhyong Kim, Xucong Teng, Jinghong Li, Xing-Jie Liang, Drew Weissman, Wei Guo & Michael J. Mitchell
Tumour-derived small extracellular vesicles act as a barrier to therapeutic nanoparticle delivery
Nature Materials (2024)
(9)
Il-Hyung Lee 1, Hiroyuki Kai 2, Lars-Anders Carlson 1, Jay T Groves 3, James H Hurley 4
Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly
Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Dec 29;112(52):15892-7.
(10)
Katarina Trajkovic 1, Chieh Hsu, Salvatore Chiantia, Lawrence Rajendran, Dirk Wenzel, Felix Wieland, Petra Schwille, Britta Brügger, Mikael Simons
Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes
Science. 2008 Feb 29;319(5867):1244-7.
(11)
Harvey T. McMahon, and Emmanuel Boucrot
Membrane curvature at a glance
Journal of Cell Science (2015) 128, 1065–1070 
(12)
Víctor Toribio, María Yáñez-Mó
Tetraspanins interweave EV secretion, endosomal network dynamics and cellular metabolism
European Journal of Cell Biology Volume 101, Issue , June–August 2022, 151229
(13)
Guillaume van Niel,1,2 Stéphanie Charrin,4,* Sabrina Simoes,1,2,* Maryse Romao,1,2,3 Leila Rochin,1,2 Paul Saftig,5 Michael S. Marks,6 Eric Rubinstein,4 and Graça Raposo1
The tetraspanin CD63 regulates ESCRT-independent and dependent endosomal sorting during melanogenesis
Dev Cell. 2011 Oct 18; 21(4): 708–721.
(14)
Rie Umeda, Yuhkoh Satouh, Mizuki Takemoto, Yoshiko Nakada-Nakura, Kehong Liu, Takeshi Yokoyama, Mikako Shirouzu, So Iwata, Norimichi Nomura, Ken Sato, Masahito Ikawa, Tomohiro Nishizawa & Osamu Nureki
Structural insights into tetraspanin CD9 function
Nature Communications volume 11, Article number: 1606 (2020) 
(15)
Luca F. R. Gebert & Ian J. MacRae
Regulation of microRNA function in animals
Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 20, pages21–37 (2019)
(16)
Hongping Xia,‡§¶ William K. C. Cheung,§,1 Samuel S. Ng,§,2 Xiaochun Jiang,¶ Songshan Jiang,‖ Johnny Sze,‡§ Gilberto K. K. Leung,** Gang Lu,‡ Danny T. M. Chan,‡ Xiu-Wu Bian,‡‡ Hsiang-fu Kung,‡‡§§ Wai Sang Poon,‡,3 and Marie C. Lin‡
Loss of Brain-enriched miR-124 MicroRNA Enhances Stem-like Traits and Invasiveness of Glioma Cells*
J Biol Chem. 2012 Mar 23; 287(13): 9962–9971.
(17)
Joachim Silber, Daniel A Lim, Claudia Petritsch, Anders I Persson, Alika K Maunakea, Mamie Yu, Scott R Vandenberg, David G Ginzinger, C David James, Joseph F Costello, Gabriele Bergers, William A Weiss, Arturo Alvarez-Buylla & J Graeme Hodgson 
miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells
BMC Medicine volume 6, Article number: 14 (2008) 
(18)
Jun Wei; Fei Wang; Ling-Yuan Kong; Shuo Xu; Tiffany Doucette; Sherise D. Ferguson; Yuhui Yang; Kayla McEnery; Krishan Jethwa; Olsi Gjyshi; Wei Qiao; Nicholas B. Levine; Frederick F. Lang; Ganesh Rao; Gregory N. Fuller; George A. Calin; Amy B. Heimberger
miR-124 Inhibits STAT3 Signaling to Enhance T Cell–Mediated Immune Clearance of Glioma
Cancer Res (2013) 73 (13): 3913–3926.
(19)
Zheng-nan Shan,1,2 Rui Tian,1 Min Zhang,1 Zhao-hua Gui,1 Jing Wu,1 Min Ding,1 Xin-Fu Zhou,2 and Jie He1
miR128-1 inhibits the growth of glioblastoma multiforme and glioma stem-like cells via targeting BMI1 and E2F3
Oncotarget. 2016 Nov 29; 7(48): 78813–78826.
(20)
D. Mustafov, S. S. Siddiqui, L. Klena, E. Karteris & M. Braoudaki
SV2B/miR-34a/miR-128 axis as prognostic biomarker in glioblastoma multiforme
Scientific Reports volume 14, Article number: 6647 (2024) 
(21)
Yihai Lin, Zhangyi Wu
MicroRNA-128 inhibits proliferation and invasion of glioma cells by targeting COX-2
Gene Volume 658, 5 June 2018, Pages 63-69
(22)
Fadila Guessous,1 Ying Zhang,1 Alexander Kofman,1 Alessia Catania,1 Yunqing Li,2 David Schiff,2 Benjamin Purow,2 and Roger Abounader1,2,*
microRNA-34a is tumor suppressive in brain tumors and glioma stem cells
Cell Cycle. 2010 Mar 15; 9(6): 1031–1036.
(23)
Deepak Bhere,1,2,7 Kaoru Tamura,1,2 Hiroaki Wakimoto,1,2,3,7 Sung Hugh Choi,1,2,7 Benjamin Purow,5 Jeremy Debatisse,1,2 and Khalid Shahcorresponding author1
microRNA-7 upregulates death receptor 5 and primes resistant brain tumors to caspase-mediated apoptosis
Neuro Oncol. 2018 Jan; 20(2): 215–224.
(24)
Zhenlin Liu 1, Zhongmin Jiang 2, Jianyong Huang 3, Shuqiang Huang 3, Yanxia Li 4, Simiao Yu 1, Shizhu Yu 5, Xiaozhi Liu 1
miR-7 inhibits glioblastoma growth by simultaneously interfering with the PI3K/ATK and Raf/MEK/ERK pathways
Int J Oncol. 2014 May;44(5):1571-80. 
(25)
Joachim Silber, Rintaro Hashizume, Tristan Felix, Sujatmi Hariono, Mamie Yu, Mitchel S. Berger, Jason T. Huse, Scott R. VandenBerg, C. David James, J. Graeme Hodgson, and Nalin Gupta
Expression of miR-124 inhibits growth of medulloblastoma cells
Neuro Oncol. 2013 Jan; 15(1): 83–90
(26)
Jessica Pierson 1, Bruce Hostager, Rong Fan, Rajeev Vibhakar
Regulation of cyclin dependent kinase 6 by microRNA 124 in medulloblastoma
J Neurooncol. 2008 Oct;90(1):1-7
(27)
Shom Goel, Johann S. Bergholz & Jean J. Zhao
Targeting CDK4 and CDK6 in cancer
Nature Reviews Cancer volume 22, pages356–372 (2022)
(28)
Jun Wei 1, Fei Wang, Ling-Yuan Kong, Shuo Xu, Tiffany Doucette, Sherise D Ferguson, Yuhui Yang, Kayla McEnery, Krishan Jethwa, Olsi Gjyshi, Wei Qiao, Nicholas B Levine, Frederick F Lang, Ganesh Rao, Gregory N Fuller, George A Calin, Amy B Heimberger
miR-124 inhibits STAT3 signaling to enhance T cell-mediated immune clearance of glioma
Cancer Res. 2013 Jul 1;73(13):3913-26
(29)
Hua Yu, Drew Pardoll & Richard Jove 
STATs in cancer inflammation and immunity: a leading role for STAT3
Nature Reviews Cancer volume 9, pages798–809 (2009)
(30)
Min Jin,1,2,* Tao Zhang,2,* Can Liu,1 Mark A. Badeaux,1 Bigang Liu,1 Ruifang Liu,1,3 Collene Jeter,1 Xin Chen,1 Alexander V. Vlassov,4 and Dean G. Tang1
MicroRNA-128 suppresses prostate cancer by inhibiting BMI-1 to inhibit tumor-initiating cells
Cancer Res. 2014 Aug 1; 74(15): 4183–4195.
(31)
Jie Xu,1,2 Lin Li,1 Pengfei Shi,1,2 Hongjuan Cui,1,2,* and Liqun Yang
The Crucial Roles of Bmi-1 in Cancer: Implications in Pathogenesis, Metastasis, Drug Resistance, and Targeted Therapies
Int J Mol Sci. 2022 Aug; 23(15): 8231.
(32)
Cristina Evangelisti 1, Maria Carolina Florian, Isabella Massimi, Carlo Dominici, Giuseppe Giannini, Silvia Galardi, Maria Cristina Buè, Simone Massalini, Heather P McDowell, Elio Messi, Alberto Gulino, Maria Giulia Farace, Silvia Anna Ciafrè]
MiR-128 up-regulation inhibits Reelin and DCX expression and reduces neuroblastoma cell motility and invasiveness
FASEB J. 2009 Dec;23(12):4276-87.
(33)
Filippo Biamonte,1 Gigliola Sica,2 Antonio Filippini,3 and Alessio D’Alessio2,*
Evidence of Reelin Signaling in GBM and Its Derived Cancer Stem Cells
Brain Sci. 2021 Jun; 11(6): 745.
(34)
Weiwei Yin 1, Feifei Gao 1, Suotao Zhang 1
MicroRNA‑34a inhibits the proliferation and promotes the chemosensitivity of retinoblastoma cells by downregulating Notch1 expression
Mol Med Rep. 2020 Aug;22(2):1613-1620. 
(35)
Dorota Anusewicz,*† Magdalena Orzechowska,† and Andrzej K. Bednarek
Notch Signaling Pathway in Cancer—Review with Bioinformatic Analysis
Cancers (Basel). 2021 Feb; 13(4): 768.
(36)
Xiaojie Lin 1, Hongyu Guan 1, Zhimin Huang 1, Juan Liu 1, Hai Li 1, Guohong Wei 1, Xiaopei Cao 1, Yanbing Li 
Downregulation of Bcl-2 expression by miR-34a mediates palmitate-induced Min6 cells apoptosis
J Diabetes Res. 2014:2014:258695
(37)
Deeksha Kaloni, Sarah T Diepstraten, Andreas Strasser & Gemma L Kelly
BCL-2 protein family: attractive targets for cancer therapy
Apoptosis　Volume 28, pages 20–38, (2023)
(38)
Fang Sun 1, Hanjiang Fu, Qin Liu, Yi Tie, Jie Zhu, Ruiyun Xing, Zhixian Sun, Xiaofei Zheng
Downregulation of CCND1 and CDK6 by miR-34a induces cell cycle arrest
FEBS Lett. 2008 Apr 30;582(10):1564-8.
(39)
Rebecca J Webster 1, Keith M Giles, Karina J Price, Priscilla M Zhang, John S Mattick, Peter J Leedman
Regulation of epidermal growth factor receptor signaling in human cancer cells by microRNA-7
J Biol Chem. 2009 Feb 27;284(9):5731-41.
(40)
Sreenath V. Sharma, Daphne W. Bell, Jeffrey Settleman & Daniel A. Haber
Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer
Nature Reviews Cancer volume 7, pages169–181 (2007)
(41)
Bela Bodey 1, Hans E Kaiser, Stuart E Siegel
Epidermal growth factor receptor (EGFR) expression in childhood brain tumors
In Vivo. 2005 Sep-Oct;19(5):931-41.
(42)
Mario Morales-Martínez1 and Mario I. Vega1
Role of MicroRNA-7 (MiR-7) in Cancer Physiopathology
Int J Mol Sci. 2022 Aug; 23(16): 9091.
(43)
Dongsic Choi 1, Laura Montermini 1, Dae-Kyum Kim 2 3, Brian Meehan 1, Frederick P Roth 2 3 4, Janusz Rak 5
The Impact of Oncogenic EGFRvIII on the Proteome of Extracellular Vesicles Released from Glioblastoma Cells
Mol Cell Proteomics. 2018 Oct;17(10):1948-1964.
(44)
Guangpeng He, Xueqiang Peng, Shibo Wei, Shuo Yang, Xinyu Li, Mingyao Huang, Shilei Tang, Hongyuan Jin, Jiaxing Liu, Sheng Zhang, Hongyu Zheng, Qing Fan, Jingang Liu, Liang Yang & Hangyu Li
Exosomes in the hypoxic TME: from release, uptake and biofunctions to clinical applications
Molecular Cancer volume 21, Article number: 19 (2022) 
(45)
Raghu Kalluri
The biology and function of exosomes in cancer
J Clin Invest. 2016 Apr 1; 126(4): 1208–1215.
(46)
Tsung-Chieh Lin1 and Michael Hsiao2,
Leptin and Cancer: Updated Functional Roles in Carcinogenesis, Therapeutic Niches, and Developments
Int J Mol Sci. 2021 Mar; 22(6): 2870.
(47)
Jacob S. Brenner, Daniel C. Pan, Jacob W. Myerson, Oscar A. Marcos-Contreras, Carlos H. Villa, Priyal Patel, Hugh Hekierski, Shampa Chatterjee, Jian-Qin Tao, Hamideh Parhiz, Kartik Bhamidipati, Thomas G. Uhler, Elizabeth D. Hood, Raisa Yu. Kiseleva, Vladimir S. Shuvaev, Tea Shuvaeva, Makan Khoshnejad, Ian Johnston, Jason V. Gregory, Joerg Lahann, Tao Wang, Edward Cantu, William M. Armstead, Samir Mitragotri & Vladimir Muzykantov
Red blood cell-hitchhiking boosts delivery of nanocarriers to chosen organs by orders of magnitude
Nature Communications volume 9, Article number: 2684 (2018)
(48)
Koushik Debnath, Kevin Las Heras, Ambar Rivera, Stephen Lenzini & Jae-Won Shin
Extracellular vesicle–matrix interactions
Nature Reviews Materials volume 8, pages390–402 (2023)
(49)
Nadya Latysheva 1, Gairat Muratov, Sundaresan Rajesh, Matthew Padgett, Neil A Hotchin, Michael Overduin, Fedor Berditchevski
Syntenin-1 is a new component of tetraspanin-enriched microdomains: mechanisms and consequences of the interaction of syntenin-1 with CD63
Mol Cell Biol. 2006 Oct;26(20):7707-18
(50)
Kwang-Min Lee,1,2,† Eun-Chan Seo,1,2,† Jeong-Hyung Lee,3 Hyo-Jin Kim,1,2,* and Cheol Hwangbo1,2,*
The Multifunctional Protein Syntenin-1: Regulator of Exosome Biogenesis, Cellular Function, and Tumor Progression
Int J Mol Sci. 2023 Jun; 24(11): 9418.
(51)
Guillaume van Niel, Gisela D'Angelo & Graça Raposo
Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles
Nature Reviews Molecular Cell Biology volume 19, pages213–228 (2018)
(52)
Daiki Marukawa 1, Kunihito Gotoh 2, Shogo Kobayashi 3, Kazuki Sasaki 1, Yoshifumi Iwagami 1, Daisaku Yamada 1, Yoshito Tomimaru 1, Hirofumi Akita 4, Tadafumi Asaoka 5, Takehiro Noda 1, Hidenori Takahashi 1, Masahiro Tanemura 6, Yuichiro Doki 1, Hidetoshi Eguchi 
Rubicon can predict prognosis in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma after neoadjuvant chemoradiotherapy
Int J Clin Oncol. 2023 Apr;28(4):576-586
(53)
Kyosuke Yanagawa, Akiko Kuma, Maho Hamasaki, Shunbun Kita, Tadashi Yamamuro, Kohei Nishino, Shuhei Nakamura, Hiroko Omori, Tatsuya Kaminishi, Satoshi Oikawa, Yoshio Kato, Ryuya Edahiro, Ryosuke Kawagoe, Takako Taniguchi, Yoko Tanaka, Takayuki Shima, Keisuke Tabata, Miki Iwatani, Nao Bekku, Rikinari Hanayama, Yukinori Okada, Takayuki Akimoto, Hidetaka Kosako, Akiko Takahashi, Iichiro Shimomura, Yasushi Sakata & Tamotsu Yoshimori
The Rubicon–WIPI axis regulates exosome biogenesis during ageing
Nature Cell Biology volume 26, pages1558–1570 (2024)