細胞外小胞のガイドラインと私の取り組み

(序論)(1)
The International Society for Extracellular Vesicles (ISEV)。
これが細胞外小胞の生物学的、医療的なニーズの高まりを受けて
2014年に
Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 
(MISEV) guidelines
すなわち、細胞外小胞の研究をするにあたり
必要最小限の不可欠な情報をガイドラインとして提供されています(2)。
この2014年のガイドラインでは
細胞外小胞の分離、特性(形質決定、評価)、機能。
これらについて定義されています。

これらのガイドライン制定の主要なゴールは
研究、編集者、総括など研究開発、科学論文に関わる人に対して
細胞外小胞の分野特異的な
実験的な必要条件、
また、科学論文で報告するときの必要条件を
広く普及させることにあります。

昨日この医療の部屋で(9/18)に発表した癌治療に対する
エクソソームのバイオマーカーとしての利用の記事があります。
(小児脳腫瘍の治療方針）
私は小児脳腫瘍に注力しますが、
当然、私の頭の中にはこうした方法、手順は
小児脳腫瘍に限らない、大人の脳腫瘍、
あるいはその他の希少な癌を含めた
全身の癌種に対して、少なくとも一部適用できるだろう
と想定して執筆しました。
エクソソームを含めた細胞外小胞は
こうした癌治療に留まらず、未来の医療において
世界に多くの果実を提供する潜在性を有しています。

細胞外小胞は広義には「細胞外」の小胞ですから
グラム陰性、グラム陽性細菌から放出される
細胞外小胞も含まれます(3,4)。
細菌由来の物を含めて細胞外小胞を今までよりも
高い特異性、高いスループットで分離する技術を開発すれば、
医療だけならず、
海、土壌、氷河、環境水などの環境調査、環境管理、
微生物の分析、(感染症を含めた)管理、
今は治療が難しい敗血症医療の発展。
医療だけにとどまらず、環境などを含めた様々な分野で応用可能です。

そうした中で細胞外小胞に関心を示す人、団体は増えており(1)、
この2018年のガイドラインの制定、報告に関与した
著者、団体、国の数は2014年よりも顕著に増えています(1,2)。
ただ、細胞外小胞は、
生物学的機序を通じて多様な様式で
細胞外に放出される自然な小胞であり、
細胞を持つあらゆる生物、より細かくは細胞種が放出するものなので、
多種多様で、術語体系も含めて、
生物学的機序まで踏み込んだ様式で定義づけする必要性があります。

我が国、日本でも、このガイドラインの制定の報告に関与し(1,5)、
国内でも日本細胞外小胞学会を結成しています。
その理事長を務められる
日本のエクソソーム研究の第一人者である
東京医科大学総合研究所の落谷孝広先生(特任教授)は
細胞外小胞を実験的に扱うにあたり、
細胞外小胞の特性の異種性が一つの大きな課題であると明言されています。
これは、産業上の応用においてもそうです。
また、日本では安易にエクソソームを医療応用する事に対して
現時点で厚生労働省、日本細胞外小胞学会を中心として
警鐘を鳴らしている実情があります。
同じようなナノ粒子である合成ナノ粒子よりも複雑で、
様々な面で取り扱いが難しく、
適性に社会に対して付加価値を提供していくためには
こうしたガイドラインの理解、関与は欠かせません(1,2,5)。
また、細胞生物学の高度な理解も必要です(6-8)。

上述したように細胞外小胞はあらゆる細胞種から
生物発生し、分泌されます。
それは、病変部位の細胞種でも同様です。
例えば、癌細胞は通常細胞よりも
多くの細胞外小胞を循環器中に放出する事が知られています。
従って、癌細胞特異的な細胞外小胞の特性があります(9,10)。
感染症においても上述した
細菌特有の細胞外小胞があるだけではなく(3,4)、
ウィルス感染を含めた細胞の炎症や
免疫細胞との関連もあります(11,12)。
また、エイジング(老化)とも関連があります(13)。
細胞が老化しても癌細胞と同様に
細胞外小胞の一つであるエクソソームの分泌が増える
と言われています(13)。
これらの主に総括論文の発表の年月からわかるとおり、
活発に研究され、その輪郭が明らかになり始めたのは
ここ10年にも満たない最近の事です。
研究開発、産業化が先走りすることがないように
世界的なコンソーシアム(ISEV)、
あるいは各国の学会(日本の場合、日本細胞外小胞学会)が
取り扱いのためのガイドラインを制定して、
それを関係者、ステークホルダーに普及させる必要があります。

そのステークホルダー(利害関係者)の一人である私が
このガイドラインについて参照し(1)、
1次評価の段階で、ブログ(医療の部屋)を通じて
日本を中心とした(日本語)世界の読者と情報共有するのは
必要不可欠な取り組みです。
iPS細胞技術利用細胞種由来のエクソソームを
(s)細胞種特異的薬物送達システムのための
薬物キャリアとして利用することを決定しています。
さらにこうした薬物(薬学)だけではなく、
診断、治療(投薬)など医療(医学)のために
高度な分離技術、マルチオミックス解析を確立し
バイオマーカーとして利用する事に
技術的に貢献する事も決定しています。
エクソソームに人生を掛けて関与していく以上、
私自身がISEVに積極的に関係性を持つ事が重要です。

世界的なつながりを持つ科学論文では、
その成果が革新的であり、
かつ社会的付加価値が高い報告であればあるほど、
第三者がその論文の手順で実験を行ったときに、
同じ(少なくとも類似する)結果が再現することが非常に重要です。
しかしながら、
細胞外小胞は様々な因子での複雑性から
再現実験を実現するための
十分な情報が提供されていないとされています(1)。
細かいことをいえば、
細胞種の個別の情報があったとしても
その細胞の酸性度、酸化ストレス、培地、受容体など
その細胞種がどういった環境的条件に曝され、
そこから細胞外小胞を抽出したかによって
細胞外小胞の内包物などが変化してしまいます。


(術語体系:Nomenclature)
ISEVは脂質2重層で囲まれ、細胞から自然に分泌された
粒子(Particles)の包括的な用語して
「細胞外小胞(Extracellular vesicle:EV)」とすることを是認しています。
ただし、この細胞外小胞は機能的な核を持たず、
自身が複製能を持たない事が前提としてあります。

多胞性エンドソーム(MVB: multivesicular body)内に含まれる
小胞内小胞（ILVs:intraluminal vesicles）。
これを経由して細胞内のエンドソームから
エクソサイトーシスされて放出される細胞外小胞を
「エクソソーム(エキソソーム):Exosome」と定義します。
一方で、
細胞膜が直接、萌芽(budding)して小胞を形成するものは
「エクトソーム:Ectosomes(microparticles/microvesicles)」
このように定義されます。

注意が必要なのは大きさで定義されるわけではありません。
エクソソームの典型的な大きさは50-150nm
エクトソームのは100-10000nmであり(14,20)
平均的には細胞膜の直接的な突起によって生じた
エクトソームのほうが大きいですが、
100-150nmの範囲は大きさとして重複します。

細胞内の生成経路は多くの場合、追跡できないので
大きさ以外の特異的なマーカーによって区別する必要がありますが、
その合意はまだとられていません(1)。
その理由は、エクソソームもエクトソームも
細胞膜の情報を膜情報として引き継ぐため、
細胞内の形成場所、機序は違っても
その資源となる物質は細胞膜で共通です。
例えば、
エクソソームはテトラスパニンが形成において
重要な役割を担っていますが、
このテトラスパニンはエクトソームの
細胞膜にも含まれる事がある事から
その形成に関わっていても、
識別できる特異的なマーカーとして指定する事ができません。
例えば、細胞骨格の断片など
両者を分ける決定的なマーカーが必要ですが、
それを見つける事は少なくとも容易ではありません。
私の現在の印象では
小さな細胞外小胞は、一部はエクトソームが含まれているものの
エクソソームと呼ばれることが多いと認識しています。

大きさによる定義もまだ決定されていません。
小さいものはSmall EVs(sEVs)とされます。
中程度、大きなものはMedium/large EVsとされます。
しかし、
その境界は100nm、200nmといった別れた見解があります(1)。

私が過去、エクソソームの科学論文を見てきた限り
エクソソームがどの細胞種から分泌されたかの
術語体系は
例えば、神経細胞からエクソソームが放出されたものは
Neuron-derived exosomesと呼ばれることが多いです(15)。
また、Neuronal Exosomeと形容詞として修飾する場合もあります(16)。
日本語では神経細胞由来エクソソームと呼ばれます。
「由来」という言葉が利用されることが一般的です(17)。
他方で
環境因子で細胞外小胞を修飾する場合もあります。
例えば、低酸素状態で分泌された細胞外小胞では
Hypoxic extracellular vesiclesと命名されることがあります(18)。
細胞死した時に生じた細胞外小胞は
アポトーシス小体(Apoptotic bodies)と呼ばれます。
癌細胞のように代表的な病変細胞から、
特異的に分泌されるエクトソームを
Oncosomesと呼ばれることがあります(19)。


(収集条件)(1)
基本的に記載必要な収集条件は
放出細胞種、培地、収穫条件(harvesting conditions)です。
また
短鎖反復配列（Short Tandem Repeat, STR）などを用いて
細胞外小胞を取得した細胞が
他の異なる細胞株で汚染されていないことを証明する必要もあります。
また、培地で細胞死している割合が大きいと
(おそらく)アポトーシス小体など
目的の機序の異なる細胞外小胞も混入してしまうため
不死化(immortalization)などを使って
細胞死の割合を収穫時に減らしておくことも重要です。
その細胞死の割合を計測、定量化し、
それを記載することも有効です。
また、
活性化、癌化、老化などを含めた細胞の特性を
明かにすることも重要です。
培地に入れた日数、細胞培養密度などもあります。
また、培地の細胞のコンフルエンス、
すなわちポストコンフルエンスに達して
細胞極性が発達して、細胞外小胞が分泌されやすい状態に
達しているかも重要です。
培地の量、培地の形、生物反応器(bioreactor)システムも
細胞外小胞の特性に影響を与える為、
再現実験を実現するためには記載が必要です。
表面コーティングの有無、
酸素濃度のなどのガスの状態も重要です。
細胞外小胞の収穫の頻度、インターバルも要素としてあります。
また、培地に微生物が入らないような処理も必要です。
微生物由来の細胞外小胞が混入する可能性があるからです。

グルコース、抗菌薬、成長因子は
細胞外小胞の産生、構成に影響を与えます。
血清のような細胞外小胞を含んでいる可能性のある
媒質要素を記載する必要があります。
理想的にはウシ胎仔血清(fetal calf serum (FCS or FBS)）
その他の種の血清がない無血清培地を組むことです。
血小板、下垂体エキス、胆汁塩などが含まれていると
外来の細胞外小胞が含まれる可能性があります。
無血清培地の使用が難しい場合や、
何らかの理由でこれらの成分を使用する必要がある場合には、
非条件培地（細胞が存在しない培地）の対照を
用意することが重要です。
この対照実験により、培地自体の寄与を評価し、
細胞から放出されたEVの正確な測定を行うことができます。
これは細胞がない条件で
バックグラウンドとしての細胞外小胞の確認を行うためです。
いつ、どのように無血清培地に変更したか？
細胞外小胞の収穫の履歴を明記する事も重要です。

完全な培地からエクソソームを得るための
いくつかの公平かつ効果的な手順があります。
例えば、18時間、100000gの超遠心分離を行う事です(21)。
遠心力を強くすれば、もっと時間を短くすることができます。

ただ、
血清を含む培地は、細胞にとって必要な
栄養素や成長因子、接着因子など。
これらを豊富に含んでいるため、
細胞の増殖、維持、分化を効果的にサポートします。
これにより、細胞培養の成功率が高まり、
研究や産業における細胞利用が容易になります。
今、エクソソームフリーの
血清を売る供給業者が増えてきているので
それを利用することも一つの有効な手段です。
これを研究開発者が利用する場合には
製品名とロット番号を報告する必要があります。

細胞外小胞、エクソソームの精製においての
熱履歴やフィルター条件を記載することも求められます。


(液体生検)
例えば、人の血液中から液体生検として
細胞外小胞を分析するときにも注意が必要です。
年齢、生物学的性別、妊娠履歴、閉経、
空腹状態、運動レベル、食事、BMI、病気の有無、既往歴。
これらは循環器の細胞外小胞に影響を与えます。
他の処理条件。
取得量、容器のタイプ、プロセス時間、
抗凝固剤の選択、攪拌条件、貯蔵温度、輸送経路。
これらについても細かい記載が必要です。


(組織取得)
オルガノイド、生体内組織も含めて
組織から細胞外小胞を取得する場合には、
血液中など液体とは異なる難しさがあります。
取得した小胞が
本当に「細胞外」の小胞かを保証する手段が難しいです。
なぜなら、組織中の一部の細胞が破壊されて
「細胞内」の小胞も混じる事があるからです。
特に細胞構造が複雑な脳の場合は顕著です。
従って、
組織から細胞外小胞を分析する場合には
こうした可能性を考慮して
どのような条件で組織を扱ったかの履歴を
正確に明記する事が重要です。


(貯蔵)
細胞外小胞は液体生検としてのバイオマーカー、
薬物送達キャリア、
あるいは食品、環境調査など
様々な用途が考えられますが、
元々、身体(生物)の中にある自然な小胞で
その寿命は私が計算する限り、20分にも満たないです。
言い換えれば、
ほとんどの細胞外小胞は20分以内に
別の細胞に取り込まれるか、肝臓などで代謝されます。
従って、もともと長期貯蔵には向かない。
この事が特性としてあるのかもしれません。

2018年時点のガイドラインでは
細胞外小胞の具体的な貯蔵条件ガイドラインは
定義されていません(1)。

低中所得国などでの利用も想定すると
室温、冷蔵温度程度で少なくとも1週間-1か月程度、
おおよその特性が維持される条件を見つけたいという事があります。
しかしながら、
-80℃という管理としては厳しく、
特別な冷却装置が必要な条件で
かつ、保存液が血漿であっても、
6か月経過すると細胞外小胞の90%以上は分解されてしまいます。
すなわち、細胞外小胞の量が1桁以上少なくなります。
(参考文献(22) FIGURE 2)
従って、最適な条件であっても
最低、1か月以内には一連のプロセスを終えたい。
このことがあります。

但し、こうした貯蔵に関する結果は、
容器、物理(環境)的条件、分析(評価)方法、温度プロファイル、
内容物に含まれる細胞外小胞の精製状態
(大きさ、特性均一性あど)
これらによって当然、変わり得ることです。
私自身も関わって、企業レベルの精度で管理した時には
変わる可能性もあるので、
今、研究レベルで示される結果を
そのまま変わりえない情報として
受け取っているわけではありません。
但し、
貯蔵時間はどのような条件にしろ基本的な因子なので
細胞外小胞を製品として扱う限りにおいては
その時間を最大限、短縮する取り組みは求められます。


(分離、精製、管理)
上述したように細胞外小胞は合成ナノ粒子とは異なり、
細胞から生物発生された細胞外に放出された小胞の総体です。
どういった条件で細胞外小胞を取得するかによりますが、
大きさ、電荷、膜構成、内容物、表面物質、形。
様々な因子で異種性があります。
また、細胞外小胞の回収率(Recovery)を上げようとすると
細胞外小胞以外の物質も含まれてしまいます。
さらに、上述した因子ごとに
特性を揃えて精製しようとする場合、
それぞれの分離工程で必ず損失が生じるので
高い回収率と高い特異性は
少なくとも2018年の段階では達成されていません
(参考文献(1) Table 1, 4) high recovery and high specificity)

ガイドラインで挙げられている分離方法は以下です。

Field-flow fractionation (FFF)
フィールドフロー分画法

Asymmetric flow field-flow fractionation (AFFF, A4F, or AF4)
非対称流動フィールドフロー分画法

Field-free viscoelastic flow
フィールドフリー粘弾性流動

Alternating current electrophoresis
交流電気泳動

Acoustic separation
音響分離

Size exclusion chromatography (SEC)
サイズ排除クロマトグラフィー

Ion exchange chromatography
イオン交換クロマトグラフィー

Microfiltration
マイクロフィルトレーション

Fluorescence-activated sorting
蛍光活性化細胞分離

Deterministic lateral displacement (DLD) arrays
決定論的側方変位アレイ

Immunoisolation or affinity isolation
免疫分離またはアフィニティ分離

Lipid affinity isolation
脂質アフィニティ分離

Precipitation/combination techniques
沈殿法・組み合わせ技術

Hydrostatic filtration dialysis
静水圧ろ過透析

High-performance liquid chromatography (HPLC) or Fast protein liquid chromatography (FPLC)
高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）/高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）

このような様々な方法がありますが、
私自身の取り組みとしては
細胞種ごとの細胞外小胞、
その中のエクソソームの高精度な分離を目指すため、
大きさは最も適切な方法で分ける事を考えますが、
特異性に関しては
免疫沈降法をさらに発展させた方法で高精度な分離を試みます。
もともとモノクローナル抗体を用いた
免疫沈降法は特異性が高いと評価されています。
(参考文献(23) Fig.3a)
具体的には沈降に関しては、重さの違いで沈降させるため
対象となる細胞外小胞よりも重い沈降媒体を利用します。
例えば、
30-150nm程度の径のエクソソームを選択的に沈降させる場合は
それよりも重い300nm以上の径の細胞外小胞を沈降媒体として利用します。
その細胞外小胞は原理的にモノクローナル抗体よりも
生物発生、クリックケミストリーなどを含めると
多くの特異的な構造体を装飾できるため、
免疫沈降よりもさらに特異性に優れる可能性があります。
エクソソームの表面マーカーは
分泌された細胞種の細胞膜のタンパク質を反映しているので
そこから、適切な表面マーカーの選定により、高度な精製を試みます。
300nm以上の径の細胞外小胞は
生物発生させる段階で多くのノイズとなる表面物質を装飾し
それが非特異性に関わるため、
最終的に1ppmレベルでの特異性を
産業レベルで達成する事を目指す中で、
乗り越えなければならない多くの課題があります。
例えば、現時点、1次評価で
パソコンの前だけで考えられる案としては
沈降媒体として利用する細胞外小胞に
できるだけ高密度な標的マーカーリガンドを装飾させます。
それが一つ、基本的な要素です。
それに対して、バックグラウンドノイズ、
すなわち意図しない表面タンパク質や糖があります。
癌像診断などと同様にS/N比の考え方によります。
シグナル、すなわち表面マーカーリガントの密度を上げる。
ノイズ、すなわちそれ以外の表面タンパク質、糖を減らす。
そのためにあらゆる対策を講じます。
例えば、分泌後に特にノイズとして感度の高い物質は
選択的に酵素などで分解して無効化することを考えます。
一方で、
標的マーカーも、
厳密に細胞種特異的なそれがあるとは限りませんし、
むしろ、そういう物質が見つかる事はおそらく稀です。
適切な表面マーカーを指定するという事は基本的にありますが、
選択的沈降といっても
一定の異なるエクソソームも普通に考えると沈降します。
1ppmというのはその「効率」ですから、
最終的には1回の沈降で最大の効率を目指しますが、
妥協的な目標としては、数回繰りかえして
その純度を上げていくという事も想定範囲にあります。
一方で、根本的な事として
例えば、脳神経系の癌細胞から放出されたエクソソームを
1ppmの精度(S/N比 = 1 * 10^6 - 10^8)で分離する事を目指すときには
どうやって、それが癌細胞から出たエクソソームか？
その実態、確からしさを評価する方法も求められます。

いずれにしても、こうした取り組みは
現時点の精製レベルを
大きく凌駕するところを目標としていますから
細胞外小胞の将来的な分離、精製に関する
ガイドライン制定にも貢献していくものです。
例えば、
こうした取り組みが貢献するところは
単に、細胞外小胞の分離技術の改善、成熟化だけではありません。
細胞種特異的な表面マーカーを探すことは
そういったデータベースを構築する事です。
これも細胞外小胞研究において大きなことです。

トップダウンプロテオーム解析などでも言われていることですが(24)、
基本的にタンパク質など生体内の物質は
多くの物質と結合したり、
それそのものが同種多量体を形成したりします。
従って、
独立な物質として存在しにくいということがあります。
言い換えれば、凝集が生じるということです。
こうした特徴は、同じように生体内の自然な物質である
細胞外小胞でも言える事です。
扱う濃度が高くなればなるほど、
「物質をそのまま分離して維持する」
この事は基本的かつ前提のようですが、
細胞外小胞を扱う私たちにとっては無視できない難しい事です。

細胞外小胞は分析、薬物キャリアにおいて
特に製品として扱う際には
その数を正確に計測して、出荷の際には示す必要があります。
そうではなく研究においても
例えば、細胞外小胞を沈降に利用する場合、
その数が重要な評価項目です。
フローサイトメトリーのような方法がありますが(1)、
高いスループットで正確に数を計測できる方法を
開発、確立する必要があります。
例えば、細胞外小胞を通過させて
その動画をイメージングするにしても
あるいは溶液中に分布する静止画をイメージングするにしても
細胞外小胞の特徴量を多次元的に定義して、
人工知能を使って数を定義するという取り組みも必要です。

細胞外小胞は細胞膜が膜として利用されます。
少なくともこれらは独立ではありません。
従って、細胞膜と同様の脂質構成を取りますが、
その脂質膜の構成は細胞膜と同様に異種性があります。
その脂質膜の材料を直接的に定義できる方法ではありませんが、
脂質膜が元々持つ、機械的特性に着目して
それに基づく蛍光発光の緩和時間を区別する方法があります(25)。
この方法によれば、
飽和脂質と不飽和脂質の比率を
この緩和時間に基づいて算出する事が可能です。

実際に細胞外小胞を表面マーカーによって
細胞種ごとにわけることができたら
それを分けて、イメージングして
人工知能の強化学習に組み込むという事は必要です。
目視では、なかなか気づかない特徴量を
統計的に抽出できる可能性があります。
例えば、
癌細胞由来のエクソソームの形は
癌細胞特異的な形状の特徴がどこかにあるかもしれません、
もし、イメージングだけで
ある一定の正確性でエクソソームを
分泌細胞種ごと分離、精製できたら、
細胞外小胞沈降の後のフィードバック評価にも利用できます。
あるいは、分離する前の混合状態で
種類ごとの数を計測できる可能性も出てきます。
細胞外小胞沈降で表面タンパク質ごとに
細胞外小胞を分離、精製する取り組みを行う中で
こうした人工知能を使った
不可視の特徴量を抽出する取り組みは並行して必要です。
ただ、対象がエクソソームの場合は
30-150nmと非常に小さいので
こうした形などによる特徴量の抽出は難航するかもしれません。
例えば
Stimulated emission depletion microscopyを使うと
100nmくらいの見え方は
Gražvydas Lukinavičius(敬称略)らが示す
Fig.6aのような精度になります(26)。
細胞外小胞、エクソソームの外周を上手に
蛍光色素（例えば、ディロカーミンやNile Redなど）で
光らせる事ができたら、
輪郭を強調して、形の評価がより正確にできるかもしれません。

上述したように
細胞外小胞の生物発生、クリックケミストリーなどで
タンパク質を結合させるときには、
モノクローナル抗体に比べて
微妙な3次元構造をmRNA、シャペロンを制御する事によって
変える事が原理的に可能です。
確かに
癌細胞から分泌される細胞外小胞は
癌細胞「だけ」が特異的に持つ膜タンパク質を持つかどうか？
また、あったとしても、100%ではないし、
径の小さなエクソソームの場合は
膜表面積が小さいため、その割合が下がる可能性もあります。
テトラスパニンと複合体化しやすい膜タンパク質は
私たちが想定している以上に限られるかもしれません。
1次評価の現時点では未知の事が多いですが
今日、それに対して、今まで示さなかった
新たな提案が２つほどあります。

この細胞外小胞を使った特異的沈降方法は
単に結合の「有無」だけがパラメータではありません。
結合には結合親和性 Binding affinity
言い換えると、平衡解離定数
Equilibrium dissociation constant(KD)。
これがそれぞれ決まってきます。
この値を当然、一定にすることはできませんが、
ある程度の範囲で桁で動かすことができます。
同じ遺伝子コードのタンパク質でも
3次元構造、結合部位によって
対となるタンパク質に対する結合親和性は大きく異なります。
例えば、
一旦、弱い結合でもいいから
対のタンパク質と結合性もつ膜タンパク質がある
エクソソームを沈降させます。
沈降したら溶液を浮上しているものと分離します。

この後、一定の力で結合を乖離する処理を行います。
例えば、超音波、電場、磁場、
摩擦(迷路構造)などがあります。
この強度を最適化して、
弱い結合の物だけが結合が解消される条件を探します。
解消されたエクソソームを浮く条件にするか？
あるいは、
再び、沈降させます。
そうすると重い複合体化したものは
重さに応じて沈降速度が違うので、
一定のカットオフ時間を設けて
重いだけをシャッターで閉めることで回収できます。
これは、1回目の沈降の時にも
エクソソームが浮く液体条件がなければ、
こうした沈む速度の違いによって分離させる事は可能です。
その感度を上げるためには、シャッターまでの
空間的距離をとればいいです。
従って、必ずしも浮上させる事が条件ではありません。
ここの距離をしっかり確保すれば、
重さに対する感度があがるので、
それほど大きな細胞外小胞を沈降媒体として
用意しなくてもいいかもしれないし、
凝集物をしっかり制御できれば、
同じ程度の大きさのエクソソームでもいいかもしれません。
但し、大きさが同じくらいであれば、
沈降させた後、沈降媒体と標的エクソソームを
区別して分離するときに工夫、手間が必要になります。

いずれにしても2回目の結合乖離の
物理的あるいは化学的刺激によって
結合が弱いものと強いものを分ける事ができます。
従って、
結合が弱いものをターゲットにすることもできるし
結合が強いものをターゲットとすることもできます。
どちらでもいいです。

摩擦(迷路構造)による乖離では
沈降させる中で迷路構造の中で物質的な摩擦によって
弱いものをはじくということです。
これのデメリットは、設計が複雑になりますが、
1回の処理で済むということがあります。

従って、細胞種特異的細胞外小胞分離技術は
膜タンパク質の遺伝子コードだけに依存されず
原理的にその結合性の強さによっても分離可能なので、
こうした組み合わせを最適化すれば、
1ppmの精度の分離の可能性は高まってきます。
もちろん、これだけでは不十分で
まだいくつかの知恵は必要です。

例えば、こういった結合力を利用した分離は
膜タンパク質だけではなく
膜構成や糖鎖などの違いによって分けられる可能性も出てきます。

後は、脳神経系から出た癌細胞由来の細胞外小胞、
全てを分析対象にしたいです。
エクソソーム以外にも
細胞膜から直接萌芽した大きな細胞外小胞(Oncosome)もあります。

机の前で考えているだけではわかりませんが、
この沈降方法は、
基本的に「浮上」と「沈降」でわけるのではなく
「沈降速度」で分けたほうが筋がいいかもしれません。
癌細胞由来の細胞外小胞全てをどのように取得したらいいか？
それについて今から考えます。

まず、患者さんの血液から得た
通常細胞由来の細胞外小胞を含めて
「大きさ」でわけます。
例えば、マイクロ孔を数段に分けて形成して
各層、ある程度の大きさ範囲で揃う細胞外小胞を取得します。

一方で、癌細胞由来の細胞外小胞の膜タンパク質に
特異的な「結合力(KD)」で結合する
タンパク質を装飾した細胞外小胞を
特定の細胞種からエンジニアリングによって分泌させます。
ここから「様々な大きさの」細胞外小胞を得ます。
それで、液体生検と同じように別バッチで
「大きさ」でわけます。
マイクロ孔を数段に分けて形成して
各層、ある程度の大きさ範囲で揃う細胞外小胞を取得します。

それぞれに対して、大きくても小さくてもいいから
「サイズの異なる組み合わせで」
癌細胞由来の細胞外小胞の膜タンパク質に
特異的な「結合力(KD)」で結合する
タンパク質を装飾した細胞外小胞を結合させます。

結合したら体積が一定割合かわるので
その体積、重さの違いを「感度よく」識別するために
沈降速度の微妙な違いを検知して、分離するため
「十分に長い」距離と
液体の粘性を下げて、できるだけ
体積、重さの違いで速度の差が出やすい溶液条件とします。
それで一定のカットオフでシャッターで閉じて
結合したものとそうでないものを分けます。

結合したものの中で、
より癌細胞由来の純度を高めるため
それぞれの大きさにおいて
電場、磁場、超音波(物理的力)、
酵素(化学的力)などによって
結合力の弱い組み合わせを乖離します。
このプロセスでは沈まないように
薄いガラスの台をスライドして入れておきます。
十分干渉させたら、台を引いて
また沈降させます。
十分な距離と低い粘性で沈降速度の違いで
結合を解消させたものと、結合したままの物を分けます。
この時、結合の弱い方を標的とした場合には
2段階で3層に分ける必要があります。
すなわち
◎結合したもの
◎結合を解消した標的
◎結合を解消した沈降媒体
これらはすべて大きさが異なるため
沈降する速度が異なるため、
それによって分離する事が可能です。

こうして分ける事によって
あらゆるサイズの癌細胞から出た細胞外小胞を抽出できます。
それによって分析できる物質の量、分子量、種類が劇的に増えます。
例えば、DNAでも分析できるシーケンス幅が増えます。


このように癌細胞由来のあらゆる細胞外小胞を集めて、
ゲノミクス(DNA,RNA)
プロテオミクス(タンパク質)
グリコーム(糖)
リピドーム(脂質)
これらの解析を内腔、細胞膜、膜表面と分けて解析する事ができたら
癌細胞の様々な特質がわかる可能性があります。
例えば、
内腔のある物質を選択的に超音波などで取り出すことができたら
内容物と(細胞膜、膜表面)物質を分ける事が可能です。

一般的にはDNA、RNA、タンパク質が注目されますが、
糖や脂質も癌の特質を知るうえで重要な情報です。

例えば、脂質の一つである
ホスファチジルセリン(phosphatidylserine)は
癌において免疫抑制的な働きがあります(27)
セラミドは細胞死シグナルと関連しているため(28)
これが少なくなるとプログラム細胞死の機能が
低下している可能性が疑われます。

こういったことは当然、糖でも当てはまります。
最終的には患者さんごと
解析スループット(処理能力)を上げて、
コストを下げないといけないのですが、
単にエクソソームの代表的な内容物である
miRNAなどだけで決まるような
話ではないという事はすでに推定されます。

最終的には例えば、細胞膜だったら
(ちょっと苦しい感じはするのですが、、、)
研究開発段階で
多数の細胞外小胞の細胞膜の
電子顕微鏡の視覚的(空間的数字)データと
細胞膜、細胞膜表面の
リピドーム、グリコーム、プロテオームの物質解析のデータ
(これがマス、統計データとなる)
これらを対応させて、人工知能強化学習で
最終的には物質解析をしなくても
電子顕微鏡で自動で測定させて、
それで画像から物質構成を推論する。
その物質構成から治療方法、治療薬の選択肢を示す。
それを先生(医師)が確認して、
最終的に治療方法を決定する。

いずれにしても個別の患者さんに対して
個別のケースごとマルチオミックス解析するのは
設備処理能力、労力、コストの面で厳しいかな？
それに対する心配があります。
そうした物質解析を画像から人工知能に推論させて
そのSEMなどの画像解析もサンプルを入れたら、
全部、機械が自動で行う。
その物質統計解析から治療方法、治療薬の選択肢を
人工知能が1つではなく、複数のパターンを提案する。
そして根拠となるデータと合わせて、理由も説明する。
それで医師が患者さんの容態を観ながら、決定する。
これだったらなんとか現実的になるかなと考えています。

内容物に関しても画像や(光学)スペクトル解析で
物質を人工知能に推論させたいです。
その解析も機械による自動です。

結局、色んな障壁を乗り越えて、
癌細胞だけの物質を扱う事が許されても、
そのマスの情報を
設備能力、人的労力、コストの問題で
個別の患者さんに対して生かせないという事では
私たちの努力も少なくとも
半分は報われないという事になります。
それなら、今の液体生検の解析でもいいよね。
このようにもなりそうです。

サンプル準備も含めて
高スループット、低コストの自動解析で
人工知能の力を借りて、現実的なものにしたいです。
ただ、そのマルチオミックス解析が
サンプル準備も含めて全て自動化されて
個別にできるということであればそれでいいです。

今は、細かいサンプル準備も含めて
電子顕微鏡測定そのもの以外は実務経験がないので
より具体的な課題が見えてこないという事があります。
ただ、どちらにしても企業に協力してもらって
専用の分析装置が必要になるという事は
おそらく間違いないです。

そう考えると
細胞外小胞の分離がどれくらいのレベルでできるか？
早期に実験して、より正確な見積もりを出さない
といけないです。
というのは、細胞外小胞の分離は「検査」なんで
直接、患者さんの身体に入れるようなものではないから、
従来の薬剤を使うのであれば、臨床試験はいらないので
医療現場で価値のあるものとして認められれば、
すぐに適用という事になると思います。
でも、その時に環境が整わず、
解析装置処理能力、人的労力、コストの問題でできない
という事が考えられます。
どちらにしろ、
細胞外小胞のエンジニアリングと
表面タンパク質に基づく分離は
細胞種特異的薬物送達システムの実現で必要なので
私としてはこの実験を優先するということになります。
ただ、
少なくとも、今現時点で、できる事が前提で
装置開発してくださいとは言えません。
そのレベルで薬を決定しないというのであればいいのですが、
せっかく癌細胞の物質情報を特異的に集める技術を開発するなら
その全ての物質を統計的に分析して
個別の患者さんに対して生かしたいという事があります。
2次評価で、先生方がどう考えられるかです。
どういった物質情報を得られるかどうかは未知の部分がありますが、
実現可能性の評価段階でも
得られた(得られそうな)情報をどう扱うのか？
それについての議論は少なくとも必要です。

おそらく、細胞外小胞、エクソソームの分離技術が
ある程度、私の想定に沿う、近い形で実現したら、
身体の中のどの細胞種から放出されたのかがわかるようになります。
今、現時点でドナー細胞がわかるのは、
人為的に特定の細胞種を培養して、
その細胞種から確かに放出された細胞外小胞であって、
それに対して
＊＊細胞由来(** cell-derived)細胞外小胞と言われます。
液体生検の細胞種でもそれがわかるようになると
それぞれそういう表記になるという事です。
あるいは、それをどの表面マーカー
あるいはどういった手段で確認したのか？
それの表記もおそらく求められます。
少なくともそうした
ドナー細胞種表記の細胞外小胞が増えるという事です。
元々、細胞外小胞はほとんどあらゆる細胞種から放出されるので
他の動物や植物の場合は難しいにしても
人由来の物に関しては
ドナー細胞種、あるいは特異的表面マーカーを
細胞外小胞と合わせて表記したいということが
ガイドラインの需要として基本的にはあると思われます。


このガイドラインを含む記事で明記が必要な事は
Exomere, Supermere。
これらをどう扱うか？です。
2018年にHaiying Zhang(敬称略)らが
B16-F10 melanoma-derived sEVs 
(皮膚の癌細胞由来の細胞外小胞)。
これとしてエクソソームよりもさらに小さい
細胞外小胞が見つかったということです。
(参考文献(29) Fig,1)
このエクソソームよりも小さな細胞外小胞は
Exomere、さらに小さいものはSupermereと呼ばれます。
日本語表記(カタカナを含めて)は定義されていません。

エクソソームと異なる
Exomereの生物発生の機序はよくわかっていません(30)。
例えば、エクソソームの生物発生に密接に関わる
テトラスパニンをExomereは表面マーカーとして含んでいるか？
生物発生機序が違うなら、
Exomereではそれが見られない可能性もあります。
細胞外小胞であるなら、
そのエンベロープ膜の構成をまずは知る必要があると思います。

いずれにしてもどういう基準でもって分類するのか？
その基準を考えるための情報が
Exomereについては進んでいません。
細胞外小胞は私の生涯を終えるまで
継続的に関わっていく分野なので
このExomere、さらにはSupermere。
これについての生物学的な理解を深める活動に参加します。

こうした不明な小さな小胞が混在しているという事は
エクソソーム精製においての一つの障害ではあります。
しかし、表面マーカー依存的に精製したときに
こうした物質が混在、干渉してくるか？
それは、実験してみればわかることです。

おそらく私が関わって、
細胞種解像度で細胞外小胞分離技術を
生検としての利用、薬物キャリアとしての利用。
この両方の目的のために技術開発していく中で
こうした混在したよりサイズの小さな小胞の実体は明らかになるし、
解析する中で、Exomere、Supermereについての物質情報も
少なくと一部はわかってくるはずなので、
それを正規に論文発表して、
国際的なガイドライン制定に貢献していく事になります。

2018年のガイドラインを今の読んでいますが(1)、
私の印象としては、
基本的なパラメータである大きさと小胞の分類に関しても
まだ、はっきり理解されていないという認識ですし、
細胞外小胞を研究や産業で扱う場合に、
どういった情報を載せればいいか？
ある程度は示されているものの、
まだ、はっきりしない部分も多くあります。
例えば、
Haiying Zhang(敬称略)らの報告を見ていても(29)、
エクソソームの下限は60nmとされているけど、
その下限が30nmとされる報告もあります。
実際、Haiying Zhang先生らの報告では
30nmの領域はExomereになるわけですが、
細胞外小胞を分泌する細胞種によって
そうした大きさの分布は異なるのか？
あるいは、どちらかのスケール設定が不正確なのか？
それも現時点ではわかりません。
その判断の為には
基本的に小胞の大きさごとに
その物質構成、幾何構造について
詳しく調べる必要が少なくともあります。
それは内容物だけではなく、
膜構成や膜タンパク質などを含めてです。

こういった基本的な情報もまだ揃っていないので、
国際的にガイドラインを定めようもない
という事情があると思われます。

少なくともExomere、Supermereを将来的に
私が薬物キャリアとして利用する可能性はセロではありません。
高いトランスサイトーシス効率の為に
小窩に高い確率で侵入できる大きさの細胞外小胞が欲しい。
この需要があるからです。




(参考文献)
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62, Benedetta Bussolati 63, Edit I Buzás 64 65, James Bryan Byrd 66, Giovanni Camussi 67, David Rf Carter 68, Sarah Caruso 13, Lawrence W Chamley 69, Yu-Ting Chang 70, Chihchen Chen 71 72, Shuai Chen 73, Lesley Cheng 13, Andrew R Chin 74, Aled Clayton 75, Stefano P Clerici 76, Alex Cocks 75, Emanuele Cocucci 77 78, Robert J Coffey 79, Anabela Cordeiro-da-Silva 80, Yvonne Couch 81, Frank Aw Coumans 82, Beth Coyle 83, Rossella Crescitelli 84, Miria Ferreira Criado 85, Crislyn D'Souza-Schorey 86, Saumya Das 87, Amrita Datta Chaudhuri 3, Paola de Candia 88, Eliezer F De Santana 89, Olivier De Wever 90 91, Hernando A Del Portillo 92 93 94, Tanguy Demaret 95, Sarah Deville 96 97, Andrew Devitt 98, Bert Dhondt 90 99 91, Dolores Di Vizio 74, Lothar C Dieterich 100, Vincenza Dolo 101, Ana Paula Dominguez Rubio 102, Massimo Dominici 103 104, Mauricio R Dourado 105 106, Tom Ap Driedonks 107, Filipe V Duarte 108, Heather M Duncan 109 110, Ramon M Eichenberger 111, Karin Ekström 112, Samir El Andaloussi 113 114, Celine Elie-Caille 34, Uta Erdbrügger 115, Juan M Falcón-Pérez 116 117, Farah Fatima 118, Jason E Fish 119 120, Miguel Flores-Bellver 121, András Försönits 65, Annie Frelet-Barrand 34, Fabia Fricke 122 123, Gregor Fuhrmann 124 125 126, Susanne Gabrielsson 127, Ana Gámez-Valero 36 128, Chris Gardiner 129, Kathrin Gärtner 130, Raphael Gaudin 131 132, Yong Song Gho 133, Bernd Giebel 134, Caroline Gilbert 26, Mario Gimona 135, Ilaria Giusti 101, Deborah Ci Goberdhan 136, André Görgens 113 137 134, Sharon M Gorski 138 139, David W Greening 13, Julia Christina Gross 140 141, Alice Gualerzi 142, Gopal N Gupta 143, Dakota Gustafson 120, Aase Handberg 144 145, Reka A Haraszti 146, Paul Harrison 147, Hargita Hegyesi 65, An Hendrix 90 91, Andrew F Hill 13, Fred H Hochberg 148 149, Karl F Hoffmann 150, Beth Holder 151 152, Harry Holthofer 153, Baharak Hosseinkhani 154, Guoku Hu 56, Yiyao Huang 155 2, Veronica Huber 156, Stuart Hunt 157, Ahmed Gamal-Eldin Ibrahim 158, Tsuneya Ikezu 159, Jameel M Inal 160, Mustafa Isin 161, Alena Ivanova 162, Hannah K Jackson 83, Soren Jacobsen 163 164, Steven M Jay 165, Muthuvel Jayachandran 166, Guido Jenster 167, Lanzhou Jiang 13, Suzanne M Johnson 168, Jennifer C Jones 169, Ambrose Jong 170 171, Tijana Jovanovic-Talisman 172, Stephanie Jung 173, Raghu Kalluri 174, Shin-Ichi Kano 175, Sukhbir Kaur 176, Yumi Kawamura 177 178, Evan T Keller 179 180, Delaram Khamari 65, Elena Khomyakova 181 182, Anastasia Khvorova 146, Peter Kierulf 183, Kwang Pyo Kim 184, Thomas Kislinger 185 186, Mikael Klingeborn 187, David J Klinke 2nd 188 189, Miroslaw Kornek 190 191, Maja M Kosanović 192, Árpád Ferenc Kovács 65, Eva-Maria Krämer-Albers 193, Susanne Krasemann 194, Mirja Krause 195, Igor V Kurochkin 196, Gina D Kusuma 195 197, Sören Kuypers 198, Saara Laitinen 199, Scott M Langevin 200 201, Lucia R Languino 202, Joanne Lannigan 203, Cecilia Lässer 84, Louise C Laurent 204, Gregory Lavieu 1, Elisa Lázaro-Ibáñez 205, Soazig Le Lay 8, Myung-Shin Lee 206, Yi Xin Fiona Lee 207, Debora S Lemos 208, Metka Lenassi 209, Aleksandra Leszczynska 210, Isaac Ts Li 211, Ke Liao 56, Sten F Libregts 212, Erzsebet Ligeti 213, Rebecca Lim 195 197, Sai Kiang Lim 214, Aija Linē 215, Karen Linnemannstöns 140 141, Alicia Llorente 216, Catherine A Lombard 95, Magdalena J Lorenowicz 217, Ákos M Lörincz 213, Jan Lötvall 84, Jason Lovett 218, Michelle C Lowry 219, Xavier Loyer 39 40, Quan Lu 220, Barbara Lukomska 221, Taral R Lunavat 222, Sybren Ln Maas 223 224, Harmeet Malhi 225, Antonio Marcilla 226 227, Jacopo Mariani 228, Javier Mariscal 74, Elena S Martens-Uzunova 167, Lorena Martin-Jaular 1, M Carmen Martinez 8, Vilma Regina Martins 229, Mathilde Mathieu 1, Suresh Mathivanan 13, Marco Maugeri 230, Lynda K McGinnis 231, Mark J McVey 232 233, David G Meckes Jr 234, Katie L Meehan 235, Inge Mertens 236 97, Valentina R Minciacchi 237, Andreas Möller 238, Malene Møller Jørgensen 239 240, Aizea Morales-Kastresana 169, Jess Morhayim 241, François Mullier 242 243, Maurizio Muraca 244, Luca Musante 115, Veronika Mussack 62, Dillon C Muth 2, Kathryn H Myburgh 218, Tanbir Najrana 245, Muhammad Nawaz 230, Irina Nazarenko 246 247, Peter Nejsum 248, Christian Neri 249, Tommaso Neri 250, Rienk Nieuwland 82, Leonardo Nimrichter 251, John P Nolan 148, Esther Nm Nolte-'t Hoen 107, Nicole Noren Hooten 252, Lorraine O'Driscoll 219, Tina O'Grady 253, Ana O'Loghlen 254, Takahiro Ochiya 255, Martin Olivier 256, Alberto Ortiz 257 258 259, Luis A Ortiz 260, Xabier Osteikoetxea 261, Ole Østergaard 262 263, Matias Ostrowski 264, Jaesung Park 133, D Michiel Pegtel 265, Hector Peinado 266, Francesca Perut 267, Michael W Pfaffl 62, Donald G Phinney 268, Bartijn Ch Pieters 269, Ryan C Pink 68, David S Pisetsky 270 271, Elke Pogge von Strandmann 272, Iva Polakovicova 273 274, Ivan Kh Poon 13, Bonita H Powell 2, Ilaria Prada 275, Lynn Pulliam 276 277, Peter Quesenberry 278, Annalisa Radeghieri 28 30, Robert L Raffai 279 276, Stefania Raimondo 280, Janusz Rak 281 256, Marcel I Ramirez 282 283, Graça Raposo 284, Morsi S Rayyan 285, Neta Regev-Rudzki 286, Franz L Ricklefs 287, Paul D Robbins 288, David D Roberts 176, Silvia C Rodrigues 289 108, Eva Rohde 290 135 291, Sophie Rome 292, Kasper Ma Rouschop 293, Aurelia Rughetti 294, Ashley E Russell 295, Paula Saá 296, Susmita Sahoo 297, Edison Salas-Huenuleo 298 299, Catherine Sánchez 300, Julie A Saugstad 301, Meike J Saul 302, Raymond M Schiffelers 303, Raphael Schneider 120 304, Tine Hiorth Schøyen 2, Aaron Scott 305, Eriomina Shahaj 156, Shivani Sharma 306 307 308, Olga Shatnyeva 205, Faezeh Shekari 18, Ganesh Vilas Shelke 309 84, Ashok K Shetty 310 311, Kiyotaka Shiba 312, Pia R-M Siljander 313 314, Andreia M Silva 315 316 317, Agata Skowronek 318, Orman L Snyder 2nd 319, Rodrigo Pedro Soares 320, Barbara W Sódar 65, Carolina Soekmadji 238 321, Javier Sotillo 111, Philip D Stahl 322, Willem Stoorvogel 107, Shannon L Stott 323 324, Erwin F Strasser 325, Simon Swift 326, Hidetoshi Tahara 327, Muneesh Tewari 179 328 329, Kate Timms 330, Swasti Tiwari 331 332, Rochelle Tixeira 13, Mercedes Tkach 1, Wei Seong Toh 333, Richard Tomasini 334, Ana Claudia Torrecilhas 335, Juan Pablo Tosar 336 337, Vasilis Toxavidis 338, Lorena Urbanelli 339, Pieter Vader 303, Bas Wm van Balkom 340, Susanne G van der Grein 107, Jan Van Deun 90 91, Martijn Jc van Herwijnen 107, Kendall Van Keuren-Jensen 341, Guillaume van Niel 342, Martin E van Royen 343, Andre J van Wijnen 344, M Helena Vasconcelos 345 346 316, Ivan J Vechetti Jr 347, Tiago D Veit 348, Laura J Vella 349 350, Émilie Velot 351, Frederik J Verweij 342, Beate Vestad 352 353 354, Jose L Viñas 58 59 60, Tamás Visnovitz 65, Krisztina V Vukman 65, Jessica Wahlgren 355, Dionysios C Watson 356 357, Marca Hm Wauben 107, Alissa Weaver 358, Jason P Webber 75, Viktoria Weber 359, Ann M Wehman 360, Daniel J Weiss 361, Joshua A Welsh 169, Sebastian Wendt 362, Asa M Wheelock 363, Zoltán Wiener 65, Leonie Witte 140 141, Joy Wolfram 364 365 366, Angeliki Xagorari 367, Patricia Xander 368, Jing Xu 138 139, Xiaomei Yan 369, María Yáñez-Mó 370 371, Hang Yin 372, Yuana Yuana 373, Valentina Zappulli 374, Jana Zarubova 375 376 377, Vytautas Žėkas 378, Jian-Ye Zhang 379, Zezhou Zhao 2, Lei Zheng 155, Alexander R Zheutlin 285, Antje M Zickler 380, Pascale Zimmermann 381 382, Angela M Zivkovic 383, Davide Zocco 384, Ewa K Zuba-Surma 33
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Hypoxic extracellular vesicles from hiPSCs protect cardiomyocytes from oxidative damage by transferring antioxidant proteins and enhancing Akt/Erk/NRF2 signaling
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The Non-Vesicular Wave: Exomeres, Supermeres and Beyond