熱に関する免疫学、細胞生物学と温熱療法の進展と今後

(背景)
これからは「水」が重要な資源なので、
海外の人からは一定の批判はあるかもしれないですが、
(循環しているので資源の無駄遣いではありません。）
日本にはお風呂、銭湯、温泉という文化があります。
来日される海外の方の中には
スーパー銭湯や温泉に価値を感じて
日本に来られている方もいると思います。
温泉は有名ですが、
スーパー銭湯も日本独自なので喜ばれると思います。
だいたい、ちょうどよい「お湯加減」
は42℃くらいと言われていますが、
もう少し、温度を下げて、半身浴すると健康に良いとも言われます。
これから秋、冬と季節が深まっていく中で
日本人にとってはお風呂の価値が上がっていきます。
実際に、42℃のお湯につかって、
身体の深部温度がどれくらいになるかわかりませんが、
少なくとも42℃になることはありません。
でも、身体を暖める事は一定の健康への効果がある事から、
温度というのは基本的な物理パラメータだけど
医療において決して無視できない重要な要素です。

基本的に感染症にかかったりすると免疫系が惹起されるので
それと同時に、身体も発熱します(Fever)。
従って、Feverと免疫系の関係性については
探せば多くの報告がありますが、
発熱で変化する温度はせいぜい1-4℃くらいです。
それも主に全身です。
逆に
局所的に体の中の温度が36℃から
40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃。
これらになった時に、身体の細胞の機能、免疫機能、
あるいは炎症疾患、免疫系疾患、脳神経系疾患、癌。
様々な温度の影響ははっきりわかっていません。
すでに1980年代に癌に関しては総括論文がありますが(13)、
深部も含めて温度を局所的に計測しながら変えられる手段が
今も含めて確立していないので、
特に生体内の連携を含めた影響を正確に評価するのは
現時点でも難しさがあるだろうと考えています。

それを実現する可能性があるのが
磁気共鳴分析/全頭部固定焦点式超音波装置です。
これは小児脳腫瘍を一番の目的として
開発を進めていく上での一つの安心材料となります。
焦点式超音波装置は脳腫瘍、
脳の局所的な温度変化(40-80℃)を計測しながら
超音波によって実現する事を目指します。
しかし、これは当然、
身体のあらゆる部分に適用される必要があります。
もし、非常に高精細に任意温度上昇と温度計測を
人や動物の身体のあらゆるところで局所的にできたら
それによって治療だけではなく、
案外、温度という基本的な事ですが、
温度に対する(細胞)生物学が進歩する事になります。
おそらくこれが普及すると
Science direct、Wiley、Springer。
いずれの世界的科学雑誌かわからないですが、
新たな雑誌を立ち上げるレベルになると思います。
ただ、温熱治療に関する論文誌はすでにあります。
International Journal of Hyperthermia
(Taylor & Francis (United States)
従って、私の中では
磁気共鳴分析/全頭部固定焦点式超音波装置。
この開発を2035年までに成功させる事は
細胞種特異的薬物送達システムを開発させること
と同じくらい最高峰に大切なことです。
前述したように
身体の中の深部の温度を非常に解像度高く
局所的に任意に変えられる事は
少なくとも現代医療にインパクトをもたらすと考えるからです。
ちゃんと気合い入れて開発すれば、
この装置は高度な研究、教育に利用できるはずです。
超音波だけではなく、磁気共鳴もできることが多いからです。

従って、私の中で計画の中の割り込みではありますが、
9月16日(月)、1日かけて
ヒートショックタンパク質を中心した
温度が体にもたらす影響について調べて、
読者に対して情報を共有します。

まずは、アメリカ合衆国のPramod Srivastava先生が
2002年にNature reviews immunologyで総括された
ヒートショックタンパク質の自然、獲得免疫系の影響について(1)
精読して、自分の開発する装置と照らし合わせながら
独自の視点で切り込んでいきたいと思います。

(内容)
ヒートショックタンパク質は熱に限らず
炎症、エタノール、活性酸素、重金属、飢餓、低酸素など
細胞が様々なストレスを受けた時に
発現が誘導されるとされています。
熱も同様ですが、熱によってヒートショックタンパク質が
どの様に発現誘導されるかの詳細な細胞な経路はよくわかっていません。

実際には細胞の熱ストレスは絶対的な温度だけではなく、
その温度にどれだけの時間曝されたかという時間の因子もあります。
実際に30秒という短時間では
50-52℃という短い時間でhsp70(ヒートショックタンパク質70kDa)の
発現が最大になったと報告されています(2)。
しかし、実際にどれだけの範囲とどの細胞種において
これが当てはまるかははっきりわかっていません。
実際にこういったhsp70の発現量の温度、時間依存性は
細胞種によっても変わる可能性があると考えられるからです。

私が開発する全頭部固定焦点式超音波装置は、
治療というコンセプトは今、すでに普及している
高密度焦点式超音波(HIFU)による治療と同じです。
実際にD E Kruse(敬称略)らのHIFUを使った
マウスの皮膚の研究では
42℃～50℃の範囲でHSP70の発現が誘導されたとあります(2)。
それらの照射時間は数秒で照射後最大で92時間まで高まる
ということでした(2)。

ヒートショックタンパク質は
抗原と複合体を作り(HSP–peptide complexes)(1)
MHCとの結合を促進する能力をもちます(3,4)。
従って、これに伴い獲得免疫系は強化されます。
(参考文献(5) FIGURE.2）
実際にPramod Srivastava(敬称略)がFigure 1に示すように(1)
抗原と複合体化したヒートショックタンパク質は
樹状細胞、マクロファージなどの
自然免疫系抗原提示細胞の受容体と結合し、
免疫機能を活性化させるサイトカインを出すだけではなく、
血管拡張させ、血流を増加させるNOの放出も促します。
実際に入浴で血管拡張する事は広く知られたことであり、
特に表皮に近い部分の細胞における
このヒートショックタンパク質による
NOの産生も関係しているかもしれません。
上述したようにCD4+T細胞、CD8+T細胞への抗原提示も促します。
このとき、ヒートショックタンパク質が
抗原提示細胞のどういた受容体と結合するかはよくわかっていません。
(Ex. CD91(6))
上述したサイトカインは自然免疫系から
ヒートショックタンパク質の受容体の結合によって促され、
それによって抗原提示とは独立に
免疫系を調整する働きがあります。

実際にヒートショックタンパク質Hsp70とペプチドの複合体の
癌ワクチンによる治療というのは
この複合体が広範に免疫機能を誘導するなら考えられることですが、
それに対する臨床試験はフェーズ3を含めると
過去、活発に行われてきたわけではありません。

ヒートショックタンパク質Hsp70は熱によって誘導されますが、
癌細胞ではこの発現が高まっている事が挙げられ、
逆にこの発現を抑制する治療が考えられるくらいです(7)。
従って、癌細胞をマイルドな熱で刺激する事は
免疫系との関係とは反対に
癌細胞を活性化させてしまう可能性も否定できません。

ヒートショックタンパク質Hsp70は
免疫機能の調整以外にもう一つ重要な機能、役目があります。
それがタンパク質の適性な折り畳み、3次元構造を
細胞質内で保証するチャペロンとしての役割りです。
Hsp70は細胞質内で
正常なたんぱく質の機能を保証するために様々な機能を
並列的に担っています。
◎タンパク質凝集の防止
◎凝集したタンパク質の個別化
◎タンパク質の3次元構造の調整
◎タンパク質の分解
◎タンパク質の細胞内小器官への転座
これらと関わっています。
(参考文献(8) Fig.1)

上述したようにこのヒートショックタンパク質70は
特に進行性の癌細胞はエネルギーを多く消費し、
多くの分泌物質を体外に放出し、
速いサイクルで細胞分裂するため
それを支えるタンパク質の細胞内産生は一般的に亢進されます。
それに対応するために、タンパク質の構造を
細胞内で調整するHsp70の量も多くなります。
こういった癌細胞に対して
40-45℃程度なマイルドな熱で刺激する事で
Hsp70の産生を促すことが
どういった効果をもたらすかははっきりわかっていません。

そもそもなぜ、熱によってHsp70が細胞内で産生されるのか？
タンパク質の3次元構造は多くの場合
疎水性相互作用によってその安定性が保証されていますが、
温度が下がったり、上がったりすると
その疎水性相互作用に変化がでて、
3次元配座が大きく変わり、構造が崩れてしまう事があります。
(参考文献(9) FIG.2)
従って、通常の体温、深部温度よりも
下がっても、上がってもHsp70の産生が上がると考えて自然です。
ゆえに、低温にさらされても(寒冷刺激)、
免疫機能が高まるという事が一部では知られていますが、
この一つのメカニズムとして
マイルドな温熱治療と同様で
Hsp70の産生が関わっている可能性があります。
例えば、
熱による細胞としての感受性が
免疫機能と独立した形で癌細胞と通常細胞どちらが高いか？
言い換えれば、温度変化に対して脆弱か？
それを考える一つの糸口としては
それぞれの細胞内で発現される
様々なたんぱく質の構造の熱安定性がどうか？という事になります。
タンパク質が多くかつ大きく変性すれば、
細胞の生存が保証されなくなるからです。
基本的に
タンパク質、核酸(遺伝子)、脂質、糖では
脂質と糖は温度感受性が低く、核酸が中程度で
タンパク質が一番、温度感受性が高いと評価されています(Open AI)。
従って、マイルドな温度刺激の場合には
タンパク質の変性について考える事が一番重要です。
例えば、癌細胞で酸性度が強ければ、
そのpHの違いによるタンパク質3次元構造の影響を考える事も一つです。
あるいは熱、温度上昇による活性酸素種などの影響による
細胞膜、遺伝子、タンパク質などの損傷に対する
修復能力がどちらが高いかということもあります。

こうした熱に対する細胞の適応を「Thermotolerance(熱耐性)」と呼びますが、
高すぎる温度や長すぎる時間によって
こうした適応能力は弱まり、細胞の機能不全、細胞死を招きます(10)。
従って、温熱療法によって、免疫機能を高めるためには
適切な温度と時間設定が必要であるということです。

癌に対する熱耐性の研究もありますが、
実際に生体内の腫瘍組織の方が、試験管で用意した腫瘍組織によりも
同じ温度、時間で3倍細胞死が起こりやすかったとされています。
癌細胞そのものよりも癌の微小環境の影響が大きいとされています(11)。
実際にRuud P.M. Dings(敬称略)らの研究でも
(特に)血管内皮、線維芽細胞、周皮細胞の方が
メラノーマよりも熱によって細胞死しやすい結果となっています(12)。
深部温度を上げるのは難しいので、
表層に近い皮膚がんとなっています。
皮膚の細胞は元々、表面近くにあり、
メラノーマに関しては太陽光に直接あたる
最表層に膨れ上がってできますから、
形質として元々熱に強いという事は十分考えられます。

1986年に腫瘍組織の熱耐性について
M.Urano(敬称略)によって総括されています(13)。
それによると通常細胞と癌細胞の熱耐性は
あまり変化がないとされています。
ただ、特に生体内においては
今ですら、解像度を上げて
局所的に温度を上げる手段が限られており、
かつ、その正確性に課題がありますから、
当然、試験管はともかくとして
当時は、特に生体内においては
正確に評価することに難しさがあったと推測されます。
また、皮膚においても、深部においても
循環器、汗腺(皮膚)による熱拡散の影響もあるため、
例えば、水の中にマウスなどの動物をつけたとしても
実際にその温度になっているかどうかは
例えば、癌細胞であれば、
その癌細胞の分子のシグナルから計測する
必要が厳密にはあります。

実際に磁気共鳴による温度測定と
焦点式超音波装置で
今までよりも深部温度を計測しながら
正確に上げられるようになったら
そうしたことは現時点でも難しい事ですから
今まで示された結果と異なるものとなる可能性があります。

実際の問題として
頭蓋内の温度を制御して上げるのはそう簡単ではありません。
2010年にハーバード大学、トロント大学が報告しているものでは
焦点位置の温度は最大で51℃でした。
また、だいたい2.0W/cm2くらいのパワー密度で
3人中、一人の患者さんは治療中、痛みを感じました。
1人は51℃ですが、他の2人は42℃、48℃でした(15)。
従って、かなりばらつきが大きいです。
当然、腫瘍がある場所や頭の形、表面積などが違いますから、
焦点位置のパワー密度が異なるのは当然です。
一方で
ExAblate 4000で保証していると温度は最大で60℃です。
おそらくトランデューサーの数が
ハーバード大学(Nathan McDannold先生)が報告している仕様とは
2倍異なる可能性があります(1024 ← 512)
ただ、一つ律速になるのは、
治療中の患者さんの痛みなどもありますが、
もう1つは頭表面の温度が上がる事です。
実質的には頭蓋骨で温度が上がりますが、
頭蓋骨直接の温度測定はできないため、表面の温度を測っていて、
そこの温度が上がりすぎると、皮膚がやけどするか、
骨に問題が出るかなどが生じます。
周りの緩衝材は水が使われています。
シリコーンジェルよりも音響インピーダンスが低いため
適しているということです。
もし、水を使うのであれば、循環させて
低温の水で頭を冷やしながら処置をすると
もう少しエネルギーを投入できるかもしれません。
(実際にExAblate 4000ではそうなっています(18)。)
子どもの頭は小さいので、
表面積効果が小さくなるので、温度が上がりやすいです。
従って、周りを水にして冷やしながら処置する事が
おそらく必要になります。
ただ、表面の近くを処理するとなると
冷やした影響が患部に至るため、温度上昇に障害が生じます。
ただ、子どもは頭蓋骨が薄いので、
この影響で余りあるほど表面積効果の違いは
キャンセルされるかもしれません。
後は、
作動周波数が700KHzくらいなのですが、
これで出せる最高の空間分解能は100μmくらいですが、
実際のExAblate 4000の仕様を見ると
1.5mm × 1.5mm × 3mmのボクセルとなっています。
この分解能をもう少し上げられたら、
原理的にはエネルギー密度が上がりますから、
最もエネルギーが高まった所の温度はあげられるはずです。
すでに1.5mm × 1.5mm × 3mmのボクセルでも
その分解能の中で温度分布があると想定されます。
(実際にその様な特性になっています(17)。）

森山脳神経センター病院 FUS センターの
堀 大樹先生らのチームによる
経頭蓋 MR ガイド下集束超音波治療では
MR温度測定を行っています。
(参考文献(17) Fig.3)
但し、この報告では(小児)脳腫瘍ではなく
対象疾患は本態性振戦です(17)。
ExAblate 4000が使われています。
最大で55℃くらいまで上がっていて、平均は52℃です。
MRIのT2強調画像で
実際に凝固壊死したかどうかも確認されています(17)。
トランスデューサーの空間は
気体を抜いた脱気水で満たすとあります(17)。
気体があるとそれだけエネルギー損失になるからです。

ExAblate 4000が普及したおかげで、
細胞の温度特性がより正確にわかるようになったかもしれません。
国立病院機構奈良医療センターの平林 秀裕先生による評価では、
43℃が細胞死するかどうかの閾値で
1℃上がるごとに細胞死する速度が2倍になり、
51℃では55秒、56℃では2秒で組織が死滅するとあります。
これは非常に貴重なデータだと思います(18)。
こうしたデータは細胞種ごとに
もっと細分化された様式で知りたいです。
深部温度を上げられることと温度測定が可能になったことで
初めて、こういったことがわかるようになりました。
という事は、今の仕様でも
小児脳腫瘍を治療する事は原理的に可能であるという事です。
ただ、特に分解能の性能をもう少し上げたいということがあります。
もっと、正確に脳腫瘍を切除するためです。
あるいはMRIも性能を高めて、
もっと細かい脳腫瘍の検出を可能にして、
この治療の適用範囲を、43℃以下の温熱治療を含めて
高めていきたいということがあります。
多分、これからデータがさらに積みあがってくるので、
私としてはそれに対して
どう付加価値を出していくかを考える事になります。
関心があるのが、
43℃未満の温度で深部温度を上げたときの免疫応答です。
免疫細胞をガドニウムか重水素でラベリングして
そのままMRIで免疫細胞がどう応答するかがみたいです。
人ではいきなりはできませんから、
マウスなどの動物に対して
集束超音波と磁気共鳴温度測定をして、
深部組織での43℃以下の免疫応答について
もう一度、正確に評価することが
この経頭蓋MRガイド下集束超音波治療 (MRgFUS) の
付加価値を高めていく上で非常に重要になります。


(参考文献)
(1)
Pramod Srivastava 
Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity
Nature Reviews Immunology volume 2, pages185–194 (2002)
(2)
D E Kruse 1, M A Mackanos, C E O'Connell-Rodwell, C H Contag, K W Ferrara
Short-duration-focused ultrasound stimulation of Hsp70 expression in vivo
Phys Med Biol. 2008 Jul 7;53(13):3641-60. 
(3)
R Suto 1, P K Srivastava
A mechanism for the specific immunogenicity of heat shock protein-chaperoned peptides
Science. 1995 Sep 15;269(5230):1585-8. 
(4)
Aaron A R Tobian 1, David H Canaday, Clifford V Harding
Bacterial heat shock proteins enhance class II MHC antigen processing and presentation of chaperoned peptides to CD4+ T cells
J Immunol. 2004 Oct 15;173(8):5130-7. 
(5)
Thiago J Borges 1, Lotte Wieten, Martijn J C van Herwijnen, Femke Broere, Ruurd van der Zee, Cristina Bonorino, Willem van Eden
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(6)
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Sensitizing tumor cells to conventional drugs: HSP70 chaperone inhibitors, their selection and application in cancer models
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