肝臓疾患とmiRNAs、細胞外小胞を使った治療の考察

miRNAsは細胞間のコミュニケーション媒体である
エクソソームによって輸送され、
複雑性はありますが、
遺伝子翻訳のスイッチの役割を果たしているため
非常に多くの疾患に関与していると考えられます。
それぞれの疾患では細胞の形質の異常が
本質的に想定されるからです。
RNA-タンパク質ネットワークは
非常に形質を決める上で重要です。
それらは冒頭で述べたエクソソームによって
傍分泌の機序で他の細胞へ伝えることもできます。
従って、
Motoyuki Otsuka(敬称略)らが示したように
肝臓の疾患にも関わります(1)。
その肝臓疾患とmiRNAsの総括(1)について
内容を参照させていただきました。
それに対して、
主に細胞外小胞の視点で追記、考察を行いました。
最後の考察では薬学に基づいた
内容からやや外れた発展的な考察となっています。
それらを読者の方と情報共有したいと思います。

//要約//ーー
microRNA(miRNA)の生物学的な役割は広範に調べられています。
miRNA122は肝臓で発現されているmiRNAsの半分以上を占め、
様々な生理学的、病理学的な機能を有しています。
それは肝炎ウィルスの複製を促進する、
脂質代謝を制御する、
肝細胞がんを抑制する。
これらなどを含みます。
miRNAは全体としてもしくは個別として
肝細胞がん生成と関連します。
さらに
いくつかのmiRNAsは
ノンアルコール性脂肪肝炎の病理を含みます。
ヌクレオチド塩基戦略を使って、
これらのmiRNAsは
潜在的な治療標的として発達するかもしれません。
miRNA発現の中の変化は血清の中で
測定できますので、
もし、miRNAsが肝臓の病態を正確に反映していたら
非侵襲のバイオマーカーとして利用できるかもしれません。
Motoyuki Otsuka(敬称略)らによる総括では
肝臓疾患における代表的なmiRNAsの
生物学的役割を示します。
未来の臨床的な応用の為に
依然として明らかになっていない
現在の問題について議論しています(1)。

//序論//ーー
MicroRNAs(miRNAs)は短い、単鎖らせん、
ノンコーディングRNAsであり、
ほとんどの生物の中で発現されています(2)。
シノラブディス・エレガンスの
miRNA lin-4の発見以来(3,4)、
1881種類のmiRNA前駆物質、
2588種類の人の成熟miRNAが
2014年の6月の時点でmiRBaseに置かれています(5)。
miRNAsは人において
タンパク質コード遺伝子の30%以上を制御しています(6-8)。
↓
この数字が重要です。
細胞外小胞やナノ粒子を使って
miRNA両方を行う際に、
どれくらいコード遺伝子の制御に関わっているかは
この治療の影響力を示します。
それが30%よりも少し上なのか？
あるいは有意にそれよりも高いのか？
いずれにしてもmiRNAsにおける
細胞内で生成されるたんぱく質生成への影響は
少なくとも小さくはないと言えます。
--
遺伝子発現の制御によって
miRNAsは様々な生理学、病理学過程に関与します(9,10)。
とりわけ
多くの研究が公表され、
特に2005年以降、
肝臓疾患におけるmiRNAsとの関連の報告が増えており、
3000を超える報告があります。
ここで結果の全てを総括する事は不可能ですが、
肝臓疾患の病理において重要であると考えられる
代表的なmiRNAsの役割について記述します(1)。

//miR122の生物学的な役割//ーー
miRNA発現は組織特異的です。
miR122は肝臓で発現される全てのmiRNAsの
半分以上を占めます。
その次に、miR192, miR199a/b-3pです。
それぞれ52%、17%、5%です(11)。
それゆえに
miR122は肝臓において重要な役割を持っていると
考えられています。
miR122の最も際立つ特徴は
C型肝炎ウィルス(HCV)の複製を促すことです。
HCVの全遺伝情報の
5'インターナルリボソームエントリー部位が
2つのmiR122結合サイトを含みます。
それが肝臓内で効果的なHCVの複製において重要です(12)。
HCV複製におけるmiR122の促進効果の
最初の報告から8年後に
miR122の効果を弱めるアンタゴニストである
MiravisenがmiRNAsベースの
初めての薬剤として開発されました。
フェーズ２の臨床試験では
Miravisenは高い寛容性を持ち、
よいウィルス学的な反応を持ちました(13)。
↓
私が調べる限りにおいては
2017年の時点でフェーズ2で止まっています。
しかし、
標的化しないmiRNAs(inhibitor)の治療として
有効かもしれない理由は
その標的先が肝臓であるからかもしれません。
基本的に薬剤は肝臓に届きやすいからです。
あとは、
miR122が肝臓内で多く発現している事も
臨床試験でフェーズ2まで進んだ理由かもしれません。
それだけ肝臓で特異性、影響力が大きいということです。
細胞外小胞や合成ナノ粒子を使った
薬剤送達システムをMiravisenに対して利用すると
より特異的な効果を発揮するかもしれません。
細胞外小胞では
肝臓に届きやすいドナー細胞由来のそれを使うことで
特に遺伝子操作などによって
標的化のための装飾をしなくても
肝臓に届きやすいという事はあるかもしれません。
--
このようにmiRNAベースの治療は
いくつかの疾患の現在の治療を変えるかもしれません。
--
miR122とHCVの相互作用の結果について
近年の研究では報告しています。
感染の間に
HCV RNAは特異的にmiR122を取り込みます。
miR122の本来の機能を損ね、
通常のmiR122標的から遠ざけます。
この「miRNAスポンジ」は
Phosphatase and tensin homolog pseudogene 1(PTENP1)。
これで当初は報告されていました。
それは
10番染色体(PTEN)から削除された
ホスファターゼ、テンシンホモログ(PTENP1)として
同じmiRNA標的シーケンスを有しています(14)。
PTENP1の通常の発現は
いくつかのmiRNAsのデコイ機能として
働くかもしれません。
それはPTENをも標的とします。
一旦、PTENP1の発現が失わえれると
デコイ機能は失われて、
その発現を減少させます。
この偽遺伝子の未確認の驚くべきデコイ機能は
miRNA機能の制御によって
腫瘍組織抑制的役割を持つかもしれません。
PTENP1に類似して
HCV RNAはmiR122のデコイとして機能し、
通常の機能を損ねます。
それがHCVの長期的な腫瘍生成能力を
促進するかもしれません(15)。
--
miR122の生物学的な役割を決定するために
miR122欠失マウスを用意しました。
マウスのmiR122欠失は
脂肪性肝炎を発達させ、
その後、肝臓腫瘍の生成の原因となりました(16,17)。
コレステロールやトリグリセリドの血清レベルは
これらのマウスで顕著に減少しました。
この結果は
miR122抑制剤を使った生体内の
従来の結果と一致します(18,19)。
miR122は脂質代謝に関与するmiRNAの初めての報告です。
miR122のアンタゴニストは
マウス、非ヒト霊長類、人で
血漿中のコレステロールレベルの
継続的な現象の結果となりました(13,18-21)。
これらの結果に関わらず、
miR122によって制御された
コレステロールレベルに従う、
分子的なメカニズムはまだ明らかにされていません。
コレステロール代謝に関連する多くの遺伝子が
miR122抑制によって影響を受けたと考えられますが、
それらは必ずしもmiR122の直接的な標的ではありません(22)。
miR122欠失のマウスは
脂肪性肝炎と脂質の減少した血清レベル両方を示したので
miR122はリポタンパク質分泌において
重要な遺伝子を標的としているかもしれません(22)。
脂質代謝のmiR122の正確な役割にアドレスするために
包括的なmiR122標的プロファイルと機能分析が重要です。
--
miR122は癌抑制因子としても働きます。
従って、
癌生成がmiR122の欠失によってマウスのケースで
生じることが確認されています(16,17)。
miR122の発現は
肝細胞がん(HCC)の半分のケースで減少しています。
とりわけ、非ウィルス性のHCCの場合は顕著です(11)。
miR122の減少した発現は
進行性、化学療法抵抗性を示すHCCに
緊密に関係します(23,24)。
それゆえに
miR122は肝臓の癌抑制因子として
重要な役割を持ちます。
--
miR122は
〇適切な肝臓成長(25,26)
〇B型肝炎ウィルス病理(27)
〇サーカディアンリズム(28)
〇鉄の代謝(29)
〇その他(25,26)
これらを含めた
他の肝臓の機能、疾患にも関与します。
それゆえに
miR122は肝臓の中で主要なmiRNAで
肝臓疾患に加えて、
様々な種類の生理学的な機能に関わります。

//miRNAの生物発生と機能//ーー
それぞれのmiRNAは肝臓内で重要な役割を持ちますが、
ほとんど全てのmiRNAsは
miRNA生物生成が損なわれているため
無秩序になっている可能性があります。
1次のmiRNAsは
ステムループ構造を含み
RNAポリメラーゼⅡによって転写されます(9)。
これらの一次miRNAsは
〇Drosha (RNAase III)(30)
〇DiGeorge syndrome critical region 
gene 8/partner of Drosha in the nucleus(31,32)
これらから構成される
マイクロプロセッサー複合体によって
生理経路が進められます。
プロセスされた産物は
〇～65-nucleotide hairpin-shaped precursors(pre-miRNA)
これであり、exportin-5を通じて
細胞質へ輸送されます(33,34)。
Pre-miRNAsは
DroshaとDicer RNA polymerase IIIによって
成熟miRNAsへへき開されます。
成熟miRNA二本鎖は
RNA誘発サイレンシング複合体上に積載され、
単一のらせん構造成熟形状にほどかれます(35-37)。
結果として生じた共複合体は
直接的に標的mRNAsの
3'-untranslated regionsを標的とします。
それによって、mRNAのへき開を促進し、
翻訳を抑制する事で
それらの発現を抑制します(9,38)。
--
DicerはほとんどのmiRNAプロセスにおいて
重要であることを考慮に入れると
Dicer遺伝子の欠失マウスでは
肝細胞において
肝臓におけるmiRNAsの生理学的な総合機能を
決定するモデルとなるかもしれません(39)。
これらの変異を含むマウスでは
肝臓の帯状分布は
カルボキシキナーゼ、Eカドヘリンのような
抹消部のタンパク質の発現を無秩序にさせます(39)。
Dicer欠失肝細胞は
明らかにわかる脂肪症やグリコーゲン貯蔵の喪失の
結果になります。
変異マウスではDicer欠失肝細胞状態が1年続くと
HCCが発展しました(39)。
肝臓におけるDicerやmiRNAs全体は
肝臓の発達や代謝の制御、
腫瘍組織抑制において重要な役割を担います(39)。
人のHCCの低いDicer発現は予後不良と関係します(40)。
↓
従って、miRNAs、特に腫瘍抑制効果を持ち
肝臓において多くの量を占める
miR122は腫瘍発生後も悪化抑制のために
重要な役割を担っている可能性があります。
--
個別のmiRNA機能を考えるだけではなく、
肝臓の病理においては
全体的なmiRNA機能について考える事も重要かもしれません。

//miRNAsとHCC//ーー
多数の報告が人のHCCにおいて
miRNAsの発現の制御不全を指摘しています。
ほとんどの研究がmiRNA候補を選び、
癌生成と関連があるかもしれない標的遺伝子を明らかにし、
癌と癌ではない組織のmiRNAの発現レベルを比較しています。
制御不全となったmiRNAの発現を示す
miRNAsのリストは
すでにいくつかの総括で示されています(41,42)。
--
miR26の発現ベルはHCCの予後と関連します(43)。
高いmiR26発現を持つ患者さんは
手術の後、良い予後を示します。
↓
従って、アドジュバント療法として
miR26を使ったmiRNA療法を
細胞外小胞やナノ粒子を使って
行う事も考えられます。
--
臨床研究の結果と一致する形で
miR26はマウスのケースで
腫瘍抑制因子として確認されました。
c-Myc誘導肝細胞がん生成のマウスモデルでは
アデノウィルスによって
miR26を輸送した時に
顕著に腫瘍バーデン(組織あたりの比率)が
抑制されました(44)。
miR26の発現はHCCを抑制し、
HCCの予防と治療の為、利用価値があるかもしれません。
--
もう一つの良く知られた
腫瘍組織抑制miRNAはlet-7です。
癌生成、RNA結合タンパク質であるLIN28とLIN28Bは
let-7前駆物質の成熟miRNAプロセスを特異的に停止させます(45)。
そのことは、これらのタンパク質の過剰発現は
let-7を抑制する事によって
悪性腫瘍生成を促進するかもしれません。
他方で
let-7はLIN28とLIN28Bを標的とし、
このタンパク質レベルを減少させます。
これらのアンタゴナイズ効果が制御不全となった時
病理的な条件が生じるかもしれません。
↓
Ref.(1) Figure 4に示されるように
let-7と(LIN28、LIN28B)。
これらはシーソーのように影響しあい
癌抑制と癌生成に関与していると考えられます。
--
炎症は癌の主要な原因であると考えられています(46,47)。
HCCは頻繁に慢性的に炎症反応を起こした肝臓組織内で
度々生じます。
慢性的な炎症とは、慢性肝炎ウィルス感染や
非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)です。
しかしながら、
慢性的な炎症と癌生成の分子的なつながりは
よくわかっていません。
miRNAsが慢性的な炎症に誘導された癌生成に
関連するかもしれません。
実際に
いくつかの研究ではこれらの関係を指摘しています。
例えば、
Lin28の転写を活性化させるNF-κBによって
仲介される炎症反応の中の
ポジティブフィードバックループ、
これらの負のスパイラルが
1つの研究によって明らかにされています(48)。
LIN28Bは上述したように
成熟したlet-7レベルを減少させます。
Let-7は通常はIL-6発現を抑制するので
結果としてLin28依存的にlet-7が抑えられる事に寄って
NF-κBの活性化はIL-6の発現レベルを上昇させます。
IL-6はNF-κBレベルを上昇させるので
これらの関係が
ポジティブフィードバックループとなります。
これは乳がん細胞種(MCF10A)でも
同じようなループが確認されています。
これらを「エピジェネティックスイッチ」と命名しています。
これらのループは
炎症反応が起こっていない場合も
無限ループとして維持されるからです。
スイッチを何らかの介入によって止めるしかありません。
--
もう一つの報告は類似していますが、
特徴的な観測を報告しています。
ジエチルニトロサミン誘導の改変肝細胞の遺伝子座(FAH)。
これの中にLIN28を発現する細胞が存在するとき、
let-7は抑制されますが、
結果としてIL-6の発現を強化します。
これは前駆物質からの悪性腫瘍の進行を仲介します。
FAH内の細胞と初期の肝細胞がん生成の細胞との間の
重要な違いはIL-6信号であり、
それは傍分泌であるということです。
それがFAH細胞内でLIN28Bの亢進による
減少されたlet-7によって仲介されます。
この機序はHCC前駆細胞から悪性腫瘍の進行に
貢献するかもしれません(49)。
この仮説は興味深いかもしれないですが、
肝細胞がん生成の中でのこれらの関連性は
応用や再現性を確かめるため、
さらなる研究が必要です。

//miRNAsとNASH//ーー
制御不全のmiRNAsはNASHの病理に関与するかもしれません(50)。
NASH内の制御不全発現が生じているmiRAsリストは
いくつかの優れた総括で記述されています(50,51)。
ここではmiR21とmiR103/107について記述します。
--
miR21レベルはNASHの患者さんとコントロール群、
単純な脂肪症の患者さんとの比較で
NASHの患者さんで亢進している事が確認されています(52)。
高脂肪食が与えられた
低密度リポタンパク質受容体(LDLR)欠失マウスは
進行性の肝臓炎症を示しました。
それはNASHモデルとして利用できます(52)。
これらのマウスの肝臓の中のmiR21の発現も上昇しています。
antagomir-21を使ったmiR21の薬剤による抑制は
肝臓炎症と肝臓線維化を減少させます。
そのことは
miR21が脂肪症によって誘導された
肝臓炎症において重要な役割を持つからです(52)。
それゆえに
antagomir-21はNASHに対する治療選択肢として
利用できるかもしれません。
重要な事に
miR21は主に炎症性や胆管細胞で発現され、
肝細胞ではそうではありません。
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α
(peroxisome proliferator-activated receptor alpha)。
これはこの研究で可能な標的として挙げられています。
NASHの病理の中野miR21の役割はまだ決定されていません。
--
miRNAとNASHについてのもう一つの画期的な研究は
miR103/107発現がアルコール性脂肪性肝炎と
NASH患者さんの肝臓で亢進されていることです(53)。
成熟miR103と107のシーケンスは
ポジション21での一つのヌクレオチドによって異なり、
ノーザンプロット法で区別できませんが、
両方のmiRNAsは
アルコール性脂肪性肝炎とNASHの肝臓で亢進されています(53)。
これらのmiRNAsの過剰発現は
グルコース非寛容性を誘導し、
antagomirs(miRアンタゴニスト)によるmiRNAsのサイレンシングは
肥満マウスのグルコース寛容性、インスリン感受性を
向上させる結果となります(53)。
この結果はmiR103とmiR107のインスリン感受性を制御します(53)。
miR103の過剰発現の遺伝子移植モデルでは
グルコース非寛容性を示しました。
miRNAs成熟を抑制するフラボノイドであるアピゲニンは
病態を改善させます(54)。
この結果は
miR103が有望な治療のターゲットであるかもしれない
ことを示しています。
この発現の改変はインスリン感受性を向上させるための
よい候補であるかもしれない事を示しています。

//診断マーカーとしてのmiRNAs//ーー
循環器の中のmiRNAsは比較的安定です(55)。
↓
miRNAsの半減期は1,5時間から13時間と
非常に寿命、安定性において幅を持っている
ことが示されています(70)。
--
miRNAsを含むノンコーディングRNAsは
死亡した細胞からや
細胞外小胞であるエクソソームやマイクロベシクル内の
内容物から放出されます。
もしくはタンパク質と結合した様式で存在します。
マイクロアレイ、PCR手法、次世代シーケンス技術は
循環したノンコーディングRNAsレベルを調べるために
使われます。
簡単に評価できる血清ベースのmiRNAsは
様々な疾患における診断や予後の目的としての
新手のバイオマーカとして利用できるかもしれません。
--
HCCのための診断マーカーとして
単一のもしくはいくつかの循環miRNAsを利用する事は
広範に報告されています。
しかしながら、
その特異性は比較的あまりないとされています(56)。
単一のmiRNAsの代わりに
多数の循環するmiRNAsを組み合わせる事は
HCCの診断、予後予測のための診断マーカーとして
より特異性と感受性を提供するかもしれません。
例えば、
6つのmiRNAs
(miR29a,29c,miR133a, miR143, miR192 and miR505)。
これらから構成されるパネルは
共通的にマーカーとして利用されるAFPよりも
HCCの診断マーカーとして高い正確性を持っていた
とされています。
これはB型肝炎ウィルス陽性の患者さんにおいて
調べられました(57)。
これらの結果は有望です。
異なるmiRNAsセットを使った7つの他のmiRNAパネルでも
同様に正確な診断が可能でした。
臨床の現場で利用価値を示すための再現性を確認するために
標準化された手順や上手に設計された研究が
将来、必要になります。
--
HCC診断のケースに類似して
いくつかのmiRNAsはNASHの診断のためのテストをしてきました。
84種類の循環miRNAsが
非アルコール性脂肪肝疾患を持つ患者さんにおいて
異なる様式で発現されているかどうか決定するために
評価されてきました(58)。
それらのうち
miR122の循環レベルが最も顕著に変わっていました。
7.2倍の変化：NASH vs controls
3.1倍の変化：NASH vs 脂肪症
miR122の血清レベルは
非アルコール性脂肪肝疾患活性スコア(NAS)と
顕著な関わりがありました。
これは軽症の状態から進行性の状態を区別するために
miR122は有効であることを示しています。
しかし、
より感受性が高く、特異的なマーカーが必要です。
いくつかのmiRNAsを使ったパネルでは
HCC診断のケースに類似します。
それはNASH診断のため必要かもしれません。
NASHの為の非信州の診断手法の発展は有望ですが、
循環型ノンコーディングRNAs(miRNAs)の信頼性の向上のため
さらなる研究が必要です。
↓
細胞外小胞内にもmiRNAsが含まれていますが、
細胞外小胞内のmiRNAsをバイオマーカーとして
検出する事はいくつかの利点があります。
1つは
細胞外小胞によってmiRNAsが分解から
守られる可能性がある事です。
しかし、
それよりも大きな特徴としては
そのmiRNAsの出どころがわかるかもしれない
ということです。
miRNAsが内包されている細胞外小胞の形質を調べれば
そのドナー細胞を推定する事ができる可能性があり、
今回の肝細胞であれば、
肝細胞から放出されたmiRNAsのみを差別化して
検出できるかもしれないということです。
なぜなら、
肝細胞から放出された細胞外小胞は
肝細胞の特異的な形質を有している可能性があるからです。
上述した血清からのmiRNAsの検出では
他の細胞から出たそれも含まれてしまいます。
それによるノイズが予想以上に大きい事も考えられます。
従って、
細胞種特異的なバイオマーカーとして
細胞外小胞中のmiRNAs、
それだけではなくタンパク質なども分析することは
今までの信頼性を超える可能性があります。

//肝臓疾患新規治療としてのmiRNAs//ーー
miRNAsはHCCで頻繁に制御不全になり、
腫瘍生成に関与している事を考慮に入れると
miRNAsは治療購入に対する
新規の分子標的であるかもしれません。
しかしながら、
多面的なmiRNA機能に関連する複雑性から
臨床試験の数は限られています(59)。
↓
臨床試験の数が限られている理由の中には
特定の細胞だけ遺伝子治療を行うための
標的化技術がまだ確立していないからである
と考えられます。
--
先発のヌクレオチド標的治療、
miravirsenはHCV複製に対して
miR122を抑制しますが、
フェーズⅡの治療では成功しています(13)。
加えて
MRX34は
Mirna Therapeuticsによって発展された
リポソームを使ったmiR-34 mimicです。
これはマウスのモデルで
完全なHCCの退行を生み出しています(60)。
フェーズⅠ研究のため
HCC治療介入によって進行性肝臓がんの
患者さんを現在集めています(NCT01829971)。
Regulus Therapeuticsは
抗HCVのためにanti-miR122(RG-101)
抗NASHのためにanti-miR103(RG-125)。
これらを開発しています。
AstraZenecaでは
フェーズⅡの患者さんの参加は
anti-miR122に対して終了しており、
anti-miR103のフェーズⅠ治験の為の
患者さんの参加募集をまさに始めようとしている
ところです。
anti-miR21とanti-miR221は
遺伝子的にHCCを発達させたマウスモデルで
生存期間を延長させることに成功しています。
これをベースに
Regulus Therapeuticsは上述した治験を行っています。
miR7 mimicはMiRevenによってHCCを標的化するために
開発されています。
Mir7はフォスフォイノシチド3キナーゼ経路を標的とし、
試験管、生体内両方で、
腫瘍成長を減少させる事を示しています(61)。
※
上述した臨床進捗状況は2017年時点。

//臨床トランスレーションのための障壁//ーー
miRNAsの生物学的な役割は広範に調べられてきました。
しかしながら、
報告された結果の再現性は
現在、満足できるものではありません。
なぜなら、
miRNAsはシーケンスマッチの曖昧性から
複数の標的と関連するからです。
mRNAが複数のmiRNAsによって標的とされる事実は
あらゆる結果の説明を複雑にします。
↓
1つのmiRNAは複数のmRNAsに関わるし、
1つのmRNAは複数にmiRNAsから関与を受けます。
従って、RNAネットワークは
1対1対応ではなく、
非常に入り組んだ、複雑なネットワーク構造となっている
と理解しています。
この入り組んでいる事は
RNAネットワークの重複性、冗長性と
関連があると考えました。
通常、特に顕著な疾患がない場合において
こういった重複性や冗長性は
内因的、外因的な擾乱に対する耐性に関係している
可能性があります。
言い換えれば、
ちょっとした毒があっても、
相互補完的な関係によって身体のバランスは
崩れないという事です。
例えば、RNAネットワークで言えば、
1つのmiRNAの数が少なくなっても、
他のmiRNAが同じのmRNAに影響を与える為
そのmRNAに対する影響を補完するといったシステムです。
ただし、そのように仮定しても、
ネットワークのコアとなる
重要なmiRNAはあるかもしれません。
各臓器、脳、癌など
明かな疾患がある場合においては
おそらくmiRNAやmRNAにおいて
健康状態とは異なる明らかな逸脱がある可能性があります。
その明らかな逸脱を正常値(その付近)に戻す事で
それぞれの疾患の進行を抑えられるか
それによって治療につながるか？
このような視点があります。
この冗長性と恒常性の仮説においては
現時点で何らかの証拠を提示できる段階にはありません。
しかし、人の身体が特に若い時期において
丈夫であるというのが
RNAネットワーク複雑性で一つ例として挙げられる
冗長性と関係している可能性があります。
一方で
治療する際にもこの冗長性が重要な可能性があります。
進行性、かつ転移性の癌は治療が難しいですが、
その理由の一つは治療耐性が生まれることです。
1つの効果的な機序を薬剤に組み込んだとしても
その臨床効果は一時的であったりします。
すでに明らかになっている事ですが、
1つの効果が切れても、2つ目、3つ目、4つ目
あるいは5つ目といったように
冗長性、つまり予備の機能を組み込むことが
持続的な治療において重要な可能性があります。
例えば、進行している癌は
組織学的に考えても、
健康な状態から大きく逸脱した病態になっています。
それを再び、健康な軌道に
しかも、全くなかった状態からその病変状態まで
行った時間よりも明らかに短い時間で
それをなくすためには大きな体への負担が
必然的に生じるかもしれません。
その場合、より予備の機能を多く備えた
冗長な治療の為の設計が必要になる可能性があります。
--
遺伝子的に修正されたマウスと
上手く制御された臨床試験のような
洗練されたモデルを使った
より確実なデータが必要になります。
↓
上述したRNAネットワークの複雑性、冗長性から
特定のmiRNA, mRNA, タンパク質の
明白な関係性を得る事は根本的に難しいかもしれません。
RNA治療において、おそらく必須となるのは
特定のmiRNA、miRNA inhibitorを
確実に狙いの細胞種に届ける事です。
非常に難しいことですが、
遺伝子治療を精緻な様式で行うためには
それが一つ必要条件になると認識しています。
--
システム生物学アプローチは
miRNAsの生物学的役割を完全に理解するために
非常に重要です。
臨床応用の前に考えるべき問題は以下のことです。
-
(1)循環miRNAsを使った利用できるバイオマーカーの
発展の為、血清の中の少量のRNAを測るための
方法、特異性、感受性が必要です。
異なる時間、サンプルからのデータを調整する
統一性のある制御と再現性も必要とします。
-
(2)miRNAsを使った効果的な治療の発展のため
病理に重要なmiRNAsの発見は重要です。
miRNAsは予後、診断マーカーとして利用できる
かもしれません。
-
(4)miRNA関連のオリゴヌクレオチドを使った
効果的な介入の発展の為、
送達方法、オリゴヌクレオチド改変の改善、
安全性はよく考えられる必要があります。
それらは複数のmRNAsを標的とし、
miRNAsは一般的に多様な効果を生み出すため、
望ましくないオフターゲット効果を生じるかもしれません。
それは特定にmiRNAを標的にしても
そのようなオフターゲットは生じるかもしれません。
↓
miRNAを使った治療は
マウスモデル、人以外の霊長類、人の生体内研究、臨床において
まずは現在の状態を精密に把握する事が必要になります。
すなわち
肝臓に対する疾患においては
コントロール群に対して
肝臓のそれぞれの細胞種において
どのmiRNAsが多くなっていて、
一方で少なくなっているかを把握する必要があります。
それをより精密にするためには
上述したように細胞種特異的に検出できるかもしれない
細胞外小胞内のmiRNAを検出する技術を確立することが
1つ案としてあります。
それは同時に正確なバイオマーカーを発展させる事とも
重複します。
目的が重なっているので、
miRNAsの細胞外小胞による検出のための研究の意義は
高いものになると考えられます。
それが達成されれば、
今度は目的の細胞種に確実に任意のmiRNAs, miRNAs inhibitor
を送達させることです。
これらが達成されたとしても
miRNAsが関与するRNAネットワークは複雑であることから
結果として生じる細胞内のタンパク質生成において
予期しないことが起こる可能性もあります。

//結論//ーー
miRNAの発見は遺伝子制御の分子的機序の理解のための
新しい可能性を開いたことに疑いの余地はありません。
この領域の発見のスピードは驚くべきものです。
実際に
miRNAsを標的とする新しい治療は
臨床試験ですでに成功を収めています。
いくつかのmiRNAsは新規のバイオマーカーとして
臨床的に利用価値があるかもしれません。
加えて、
肝細胞がん生成の病理における
新手のコンセプトの発見はmiRNAが関与します。
しかしながら、
いくつかの重要な問題が解決されていません。
継続的な研究がmiRNAsと関連する病理の理解における
革新的なコンセプトの発展が需要です。
それは臨床試験に得られた知見を活かすためにも
必要となります。

//細胞外小胞の観点//ーー
細胞外小胞のドナー細胞の選択によって
どの臓器に蓄積されるかは変わります。
その中で自然に蓄積されやすい臓器として肝臓があるので
肝臓を標的化する事は
他の臓器や組織よりも比較的容易である可能性があります。
例えば、
Stefania Bruno(敬称略)らは
マウスのモデルで
ヒト肝臓幹細胞由来の細胞外小胞は
脾臓、腎臓、肺と比較して
顕著な量、肝臓に輸送されている事が確かめています(62)。
(Figure 3より)。
他に
Oscar P. B. Wiklander(敬称略)らは
細胞外小胞の生体内分布を
細胞種ごとに比較しています(63)。
CSC12(筋細胞種), 
B16F10(メラノーマ細胞種), 
DC(骨髄由来の樹状細胞)からの細胞外小胞では
全体的に肝臓での取り込みが高いものの
DC由来では相対的に脾臓の取り込みが高まっています。
C2C12が肝臓の取り込み率が一番高いです。
(Figure.4より)
樹状細胞由来の細胞外小胞が
脾臓での取り込みが高いのは
元々脾臓の中には抗原提示機能の中で
多様な樹状細胞が含まれている(64)からである
と考えられます。
つまり、脾臓と樹状細胞との親和性、
相互作用性が高い可能性です。
樹状細胞の形質をそこから放出される
細胞外小胞が引き継いでいると考えられるので、
樹状細胞由来の細胞外小胞も
同様に脾臓と親和性、相互作用性が高い
可能性があります。
脾臓の細胞種に結合親和性の高い表面タンパク質を
樹状細胞由来の細胞外小胞は
多く発現しているかもしれません。
従って、
肝臓での取り込みを上げるための合理的な選択としては
肝臓の組織で様々な細胞種に分化する事が可能である
肝臓幹細胞などを細胞外小胞のドナー細胞として
選択する事であると想定しています。
特異性では研究が異なるものの
この細胞種の細胞外小胞の肝臓への取り込みが
一番高くなっています(62,63)。
--
薬剤送達効率を高めるために
細胞外小胞をエンジニアリングして
標的の細胞種特異的な表面タンパク質の結合部位に対して
結合親和性の高い表面タンパク質を細胞外小胞に
ドナー細胞に遺伝子を導入する事で
形成するにしても、
そのドナー細胞はナイーブな状態でも
その細胞種が属する組織、臓器に届きやすいものを
選択する事が大切かもしれません。
脳、肺、腎臓、心臓など
それぞれの臓器には幹細胞があります。
その幹細胞をドナー細胞の候補に入れる事は
上述した肝臓幹細胞の結果からも
合理的かもしれません。
例えば、
神経幹細胞由来の細胞外小胞は
アルツハイマー病の病態をマウスのケースで
抑制する事が示されています(65)。
他には、
脳卒中の後の脳の修復
牛海綿状脳症、
パーキンソン病、
ALSなど
様々な疾患を対象に研究されています(66)。
脳以外では間葉系幹細胞由来の細胞外小胞の研究が活発ですが、
それよりも標的となる臓器、組織が決まっているなら
その臓器、組織特異的な幹細胞由来の
細胞外小胞を使う方が標的性や
治療効果は高まる可能性があります。
その各種幹細胞の製造の面では
iPS細胞技術が適している可能性があります。
--
もし、各臓器、組織の多能性を持つ幹細胞由来の
細胞外小胞がそれぞれ属する臓器、組織に
ナイーブな状態で、ある程度、特異性、走化性を
有しているという事が当てはまれば、
次にしたい事は、
その細胞外小胞の膜や表面タンパク質の解析です。
そのプラズマ膜(脂質、リン2重層構成)や
表面タンパク質、形状(表面モフォロジー)などを解析することで
「なぜ、特定の臓器、組織に走化性を有しているのか？」
という事が明らかになる可能性があります。
もちろん、
標的細胞と細胞外小胞のそれぞれの表面タンパク質が
鍵と鍵穴の関係で、強い結合関係にあるという事が
想定されますが、
想定外の何らかの機序が浮かび上がるかもしれません。
それによって
薬剤搭載や標的性のアップなど
付加的な機能を組み込むうえでのヒントになるかもしれません。
その中には現在、ナノ医療で苦闘している
人での応用におけるコロナ形成など
表面タンパク質が変性してしまう課題を解決する
ためのヒントがあるかもしれません。
一方、
何か手を加える事(エンジニアリング)で、
元々あった機能を失ったり、
あるいは免疫、肝臓クリアランスなどの
別の機序で機能が損なわれる事もあるかもしれません。
その時に「基準はどこにあるか？」
という参照点、原点(ナイーブ状態)がわかれば、
人為的にエンジニアリングした時に生じうる
副作用の原因究明に貢献する可能性があります。
その基準を見つけるためにも
ナイーブな状態で標的性の優れた
細胞外小胞の徹底的な解析が大切になります。
これは自然界から技術開発のヒントを得る
ネイチャーテクノロジーの考え方に従うものです。
--
一方で、このように幹細胞由来の
細胞外小胞を使う場合においては
幹細胞自身の免疫原性や細胞外小胞のそれを
調べる事が重要になります。
ほとんどの幹細胞は
T細胞活性を誘導するMHC-Ⅰの発現は低く、
MHC-Ⅱはほとんどないとされています(67,68)。
しかしながら、
試験管では免疫原性がなかったものの
生体内では免疫原性が生じたと言われています(67,69)。
これは幹細胞自身の結果であり
そこから放出される細胞外小胞の方は
より免疫原性が小さい可能性はあります。
幹細胞を使った研究は
間葉系幹細胞を中心に細胞治療として
活発に研究されています。
一方で、
その幹細胞由来の細胞外小胞の細胞フリー治療は
まだ細胞治療に比べるとさらに黎明期です。
しかし、細胞外小胞だからこそ
活かせる特徴がある可能性があります。
代謝機能、増殖機能がなく、
送達媒体としての機能に特化しているということであれば、
より薬剤送達システムや細胞種特異的輸送系統においては
適した選択肢である可能性もあります。
さらに、同種異系ではなく
自家移植の場合はHLA型など生体互換性が高まるため
当然免疫的な副作用は小さくなると考えられます。
--

(参考文献)
(1)
Motoyuki Otsuka, Takahiro Kishikawa, Takeshi Yoshikawa, Mari Yamagami, Motoko Ohno, Akemi Takata, Chikako Shibata, Rei Ishibashi & Kazuhiko Koike 
MicroRNAs and liver disease
Journal of Human Genetics volume 62, pages75–80 (2017)
(2)
Carrington, J. & Ambros, V. Role of microRNAs in plant and animal development.
Science 301, 336 – 338 (2003).
(3)
Lee, R. C., Feinbaum, R. L. & Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4
encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75, 843 – 854
(1993).
(4)
Wightman, B., Ha, I. & Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic
gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell 75,
855 – 862 (1993).
(5)
Kozomara, A. & Grif fi ths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and
deep-sequencing data. Nucleic Acids Res. 39, D152 – D157 (2011).
(6)
John, B., Enright, A. J., Aravin, A., Tuschl, T., Sander, C. & Marks, D. S. Human
MicroRNA targets. PLoS Biol. 2, e363 (2004).
(7)
Krek, A., Grün, D., Poy, M. N., Wolf, R., Rosenberg, L., Epstein, E. J. et al.
Combinatorial microRNA target predictions. Nat. Genet. 37, 495 – 500 (2005).
(8)
Lewis, B. P., Burge, C. B. & Bartel, D. P. Conserved seed pairing, often fl anked by
adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell 120,
15 – 20 (2005).
(9)
Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350 – 355 (2004).
(10)
Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116,
281 – 297 (2004).
(11)
Hou, J., Lin, L., Zhou, W., Wang, Z., Ding, G., Dong, Q. et al. Identi fi cation of
miRNomes in human liver and hepatocellular carcinoma reveals miR-199a/b-3p as
therapeutic target for hepatocellular carcinoma. Cancer Cell 19, 232 – 243 (2011).
(12)
Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M. & Sarnow, P. Modulation of
hepatitis C virus RNA abundance by a liver-speci fi c MicroRNA. Science 309,
1577 – 1581 (2005).
(13)
Janssen, H. L., Reesink, H. W., Lawitz, E. J., Zeuzem, S., Rodriguez-Torres, M.,
Patel, K. et al. Treatment of HCV infection by targeting microRNA. N. Engl. J. Med.
368, 1685 – 1694 (2013).
(14)
Poliseno, L., Salmena, L., Zhang, J., Carver, B., Haveman, W. J. & Pandol fi , P. P.
A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour
biology. Nature 465, 1033 – 1038 (2010).
(15)
Luna, J. M., Scheel, T. K., Danino, T., Shaw, K. S., Mele, A., Fak, J. J. et al. Hepatitis C
virus RNA functionally sequesters miR-122. Cell 160, 1099 – 1110 (2015).
(16)
Tsai, W. C., Hsu, S. D., Hsu, C. S., Lai, T. C., Chen, S. J., Shen, R. et al. MicroRNA-122
plays a critical role in liver homeostasis and hepatocarcinogenesis. J. Clin. Invest. 122,
2884 – 2897 (2012).
(17)
Hsu, S. H., Wang, B., Kota, J., Yu, J., Costinean, S., Kutay, H. et al. Essential
metabolic, anti-in fl ammatory, and anti-tumorigenic functions of miR-122 in liver.
J. Clin. Invest. 122, 2871 – 2883 (2012).
(18)
Elmen, J., Lindow, M., Schutz, S., Lawrence, M., Petri, A., Obad, S. et al.
LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature 452, 896 – 899
(2008).
(19)
Lanford, R. E., Hildebrandt-Eriksen, E. S., Petri, A., Persson, R., Lindow, M.,
Munk, M. E. et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic
hepatitis C virus infection. Science 327, 198 – 201 (2010).
(20)
Esau, C., Davis, S., Murray, S. F., Yu, X. X., Pandey, S. K., Pear, M. et al. miR-122
regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metab. 3,
87 – 98 (2006).
(21)
Krutzfeldt, J., Rajewsky, N., Braich, R., Rajeev, K., Tuschl, T., Manoharan, M. et al.
Silencing of microRNAs in vivo with ‘ antagomirs ’ . Nature 438, 685 – 689 (2005).
(22)
Lewis, A. P. & Jopling, C. L. Regulation and biological function of the liver-speci fi c
miR-122. Biochem. Soc. Trans. 38, 1553 – 1557 (2010).
(23)
Kojima, K., Takata, A., Vadnais, C., Otsuka, M., Yoshikawa, T., Akanuma, M. et al.
MicroRNA122 is a key regulator of alpha-fetoprotein expression and in fl uences the
aggressiveness of hepatocellular carcinoma. Nat. Commun. 2, 338 (2011).
(24)
Kishikawa, T., Otsuka, M., Ohno, M., Yoshikawa, T., Takata, A. & Koike, K. Circulating
RNAs as new biomarkers for detecting pancreatic cancer. World J. Gastroenterol. 21,
8527 – 8540 (2015).
(25)
Xu, H., He, J., Xiao, Z., Zhang, Q., Chen, Y., Zhou, H. et al. Liver-enriched transcription
factors regulate microRNA-122 that targets CUTL1 during liver development.
Hepatology 52, 1431 – 1442 (2010).
(26)
Laudadio, I., Manfroid, I., Achouri, Y., Schmidt, D., Wilson, M. D., Cordi, S. et al.
A feedback loop between the liver-enriched transcription factor network and miR-122
controls hepatocyte differentiation. Gastroenterology 142, 119 – 129 (2012).
(27)
Wang, X. W., Heegaard, N. H. & Orum, H. MicroRNAs in liver disease. Gastroenterology
142, 1431 – 1443 (2012).
(28)
Gat fi eld, D., Le Martelot, G., Vejnar, C., Gerlach, D., Schaad, O., Fleury-Olela, F. et al.
Integration of microRNA miR-122 in hepatic circadian gene expression. Genes Dev. 23,
1313 – 1326 (2009).
(29)
Castoldi, M., Vujic Spasic, M., Altamura, S., Elmén, J., Lindow, M., Kiss, J. et al. The
liver-speci fi c microRNA miR-122 controls systemic iron homeostasis in mice. J. Clin.
Invest. 121, 1386 – 1396 (2011).
(30)
Lee, Y., Ahn, C., Han, J., Choi, H., Kim, J., Yim, J. et al. The nuclear RNase III Drosha
initiates microRNA processing. Nature 425, 415 – 419 (2003).
(31)
Han, J., Lee, Y., Yeom, K. H., Kim, Y. K., Jin, H. & Kim, V. N. The Drosha-DGCR8
complex in primary microRNA processing. Genes Dev. 18, 3016 – 3027 (2004).
(32)
Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F. & Hannon, G. J. Processing of
primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature 432, 231 – 235 (2004).
(33)
Yi, R., Qin, Y., Macara, I. G. & Cullen, B. R. Exportin-5 mediates the nuclear export of
pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev. 17, 3011 – 3016 (2003).
(34)
Lund, E., Güttinger, S., Calado, A., Dahlberg, J. E. & Kutay, U. Nuclear export of
microRNA precursors. Science 303, 95 – 98 (2004).
(35)
Maniataki, E. & Mourelatos, Z. A human, ATP-independent, RISC assembly machine
fueled by pre-miRNA. Genes Dev. 19, 2979 – 2990 (2005).
(36)
Mourelatos, Z., Dostie, J., Paushkin, S., Sharma, A., Charroux, B., Abel, L. et al.
miRNPs: a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs. Genes
Dev. 16, 720 – 728 (2002).
(37)
Gregory, R. I., Chendrimada, T. P., Cooch, N. & Shiekhattar, R. Human RISC couples
microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing. Cell 123, 631 – 640 (2005).
(38)
Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136,
215 – 233 (2009).
(39)
Sekine, S., Ogawa, R., Ito, R., Hiraoka, N., McManus, M. T., Kanai, Y. et al.
Disruption of Dicer1 induces dysregulated fetal gene expression and promotes
hepatocarcinogenesis. Gastroenterology 136, 2304 – 2315. e1 – e4. (2009).
(40)
Kitagawa, N., Ojima, H., Shirakihara, T., Shimizu, H., Kokubu, A., Urushidate, T. et al.
Downregulation of the microRNA biogenesis components and its association with poor
prognosis in hepatocellular carcinoma. Cancer Sci. 104, 543 – 551 (2013).
(41)
Otsuka, M., Kishikawa, T., Yoshikawa, T., Ohno, M., Takata, A., Shibata, C. et al. The
role of microRNAs in hepatocarcinogenesis: current knowledge and future prospects.
J. Gastroenterol. 49, 173 – 184 (2014).
(42)
Wu, Q., Liu, H. O., Liu, Y. D., Liu, W. S., Pan, D., Zhang, W. J. et al. Decreased
expression of hepatocyte nuclear factor 4 α (Hnf4 α )/MicroRNA-122 (miR-122) axis in
hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma enhances potential oncogenic
GALNT10 protein activity. J. Biol. Chem. 290, 1170 – 1185 (2015).
(43)
Ji, J., Shi, J., Budhu, A., Yu, Z., Forgues, M., Roessler, S. et al. MicroRNA expression,
survival, and response to interferon in liver cancer. N. Engl. J. Med. 361, 1437 – 1447
(2009).
(44)
Kota, J., Chivukula, R. R., O ’ Donnell, K. A., Wentzel, E. A., Montgomery, C. L.,
Hwang, H. W. et al. Therapeutic microRNA delivery suppresses tumorigenesis in a
murine liver cancer model. Cell 137, 1005 – 1017 (2009).
(45)
Viswanathan, S. R., Daley, G. Q. & Gregory, R. I. Selective blockade of microRNA
processing by Lin28. Science 320, 97 – 100 (2008).
(46)
Clevers, H. At the crossroads of in fl ammation and cancer. Cell 118, 671 – 674 (2004).
(47)
Grivennikov, S. I., Greten, F. R. & Karin, M. Immunity, in fl ammation, and cancer. Cell
140, 883 – 899 (2010).
(48)
Iliopoulos, D., Hirsch, H. A. & Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB,
Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6 links in fl ammation to cell transformation. Cell 139,
693 – 706 (2009).
(49)
He, G. et al. Identi fi cation of Liver Cancer Progenitors Whose Malignant Progression
Depends on Autocrine IL-6 Signaling. Cell 155, 384 – 396 (2013).
(50)
Zarfeshani, A., Ngo, S. & Sheppard, A. M. MicroRNA Expression Relating to
Dietary-Induced Liver Steatosis and NASH. J. Clin. Med. 4, 1938 – 1950 (2015).
(51)
Szabo, G. & Csak, T. Role of MicroRNAs in NAFLD/NASH. Dig. Dis. Sci. 61,
1314 – 1324 (2016).
(52)
Loyer, X., Paradis, V., Hénique, C., Vion, A. C., Colnot, N., Guerin, C. L. et al. Liver
microRNA-21 is overexpressed in non-alcoholic steatohepatitis and contributes to the
disease in experimental models by inhibiting PPAR α expression. Gut. doi:10.1136/
gutjnl-2014-308883 (2015).
(53)
Trajkovski, M., Hausser, J., Soutschek, J., Bhat, B., Akin, A., Zavolan, M. et al.
MicroRNAs 103 and 107 regulate insulin sensitivity. Nature 474, 649 – 653 (2011).
(54)
Ohno, M., Shibata, C., Kishikawa, T., Yoshikawa, T., Takata, A., Kojima, K. et al.
The fl avonoid apigenin improves glucose tolerance through inhibition of microRNA
maturation in miRNA103 transgenic mice. Sci. Rep. 3, 2553 (2013).
(55)
Mitchell, P. S., Parkin, R. K., Kroh, E. M., Fritz, B. R., Wyman, S. K.,
Pogosova-Agadjanyan, E. L. et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers
for cancer detection. Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 10513 – 10518 (2008).
(56)
Zhang, Y. C., Xu, Z., Zhang, T. F. & Wang, Y. L. Circulating microRNAs as diagnostic
and prognostic tools for hepatocellular carcinoma. World J. Gastroenterol. 21,
9853 – 9862 (2015).
(57)
Lin, X. J., Chong, Y., Guo, Z. W., Xie, C., Yang, X. J., Zhang, Q. et al. A serum microRNA
classi fi er for early detection of hepatocellular carcinoma: a multicentre, retrospective,
longitudinal biomarker identi fi cation study with a nested case-control study. Lancet
Oncol. 16, 804 – 815 (2015).
(58)
Pirola, C. J., Fernández Gianotti, T., Castaño, G. O., Mallardi, P., San Martino, J.,
Mora Gonzalez Lopez Ledesma, M. et al. Circulating microRNA signature in non-
alcoholic fatty liver disease: from serum non-coding RNAs to liver histology and disease
pathogenesis. Gut. 64, 800 – 812 (2015).
(59)
Shibata, C., Otsuka, M., Kishikawa, T., Yoshikawa, T., Ohno, M., Takata, A. et al.
Current status of miRNA-targeting therapeutics and preclinical studies against
gastroenterological carcinoma. Mol. Cell. Ther. 1, 5 (2013).
(60)
Xu, Y., Liu, L., Liu, J., Zhang, Y., Zhu, J., Chen, J. et al. A potentially
functional polymorphism in the promoter region of miR-34b/c is associated with an
increased risk for primary hepatocellular carcinoma. Int. J. Cancer 128, 412 – 417
(2011).
(61)
Fang, Y., Xue, J. L., Shen, Q., Chen, J. & Tian, L. MicroRNA-7 inhibits tumor
growth and metastasis by targeting the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway in
hepatocellular carcinoma. Hepatology 55, 1852 – 1862 (2012).
(62)
Stefania Bruno, Chiara Pasquino, Maria Beatriz Herrera Sanchez, Marta Tapparo, Federico Figliolini, Cristina Grange, Giulia Chiabotto, Massimo Cedrino, Maria Chiara Deregibus, Ciro Tetta, and Giovanni Camussi
HLSC-Derived Extracellular Vesicles Attenuate Liver Fibrosis and Inflammation in a Murine Model of Non-alcoholic Steatohepatitis
Mol Ther. 2020 Feb 5; 28(2): 479–489.
(63)
Oscar P. B. Wiklander, Joel Z. Nordin, Aisling O'Loughlin, Ylva Gustafsson, Giulia Corso, Imre Mäger, Pieter Vader, Yi Lee, Helena Sork, Yiqi Seow, Nina Heldring, Lydia Alvarez-Erviti, CI Edvard Smith, Katarina Le Blanc, Paolo Macchiarini, Philipp Jungebluth, Matthew J. A. Wood & Samir EL Andaloussi
Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting
Journal of Extracellular Vesicles 2015, 4, 26316
(64)
Ying Y Hey, Helen C O'Neill
Murine spleen contains a diversity of myeloid and dendritic cells distinct in antigen presenting function
J Cell Mol Med. 2012 Nov;16(11):2611-9
(65)
Lauren A. Apodaca, Al Anoud D. Baddour, Camilo Garcia Jr, Leila Alikhani, Erich Giedzinski, Ning Ru, Anshu Agrawal, Munjal M. Acharya & Janet E. Baulch 
Human neural stem cell-derived extracellular vesicles mitigate hallmarks of Alzheimer’s disease
Alzheimer's Research & Therapy volume 13, Article number: 57 (2021) 
(66)
Andrew Vogel, Raghavendra Upadhya, Ashok K. Shetty
Neural stem cell derived extracellular vesicles: Attributes and prospects for treating neurodegenerative disorders
EBioMedicine 38 (2018) 273–282
(67)
Dominique Charron
Allogenicity & immunogenicity in regenerative stem cell therapy
Indian J Med Res. 2013 Nov; 138(5): 749–754.
(68)
Wu DC, Boyd AS, Wood KJ. 
Embryonic stem cells and their differentiated derivatives have a fragile immune privilege but still represent novel targets of immune attack. 
Stem Cells. 2008;26:1939–50.
(69)
Charron D, Suberbielle-Boissel C, Al-Daccak R. 
Immunogenicity and allogenicity: a challenge of stem cell therapy. 
J Cardiovasc Transl Res. 2009;2:130–8
(70)
Anna M. L. Coenen-Stass, Marie J. Pauwels, Britt Hanson, Carla Martin Perez, Mariana Conceição, Matthew J. A. Wood, Imre Mäger, and Thomas C. Robertsa,
Extracellular microRNAs exhibit sequence-dependent stability and cellular release kinetics
RNA Biol. 2019 May; 16(5): 696–706.