細胞膜自発的細孔形成、再封鎖を利用した細胞外小胞へのmiRNA積載の視覚的分析

//概要//ーー
MicroRNA(miRNA)は細胞外小胞の積載物で
細胞間の相互作用に関係します。
miRNAは遺伝子の発現を調整する役割もあるため、
遺伝子発現が細胞の形質に影響を色濃く与えるという
広く知られている事実から、
細胞外小胞によるmiRNAの細胞間の輸送は
傍分泌、内分泌の機序で他の受け細胞の形質に
影響を与えると考えられます。
-ー
病気の状態、遺伝子/代謝の変化、細胞タイプ内での相違
のような細胞の環境への反応は
細胞外小胞への輸送物仕分けを強く制御します。
しかしながら、
細胞外小胞形成中の表面形状(形態:morphological)の特徴や
miRNA積載に関与する分泌は知られていません。
この研究では
細胞リシーリング(再封鎖)を使った
新しい細胞外小胞積載の方法を開発されています(1)。
これは細菌毒素により一旦穴を形成し、
その後、自己組織化によって穴が閉塞する
ことを意味します。
その中で、
基本的なmiRNA積載プロセスを再構築します。
再封鎖されたHeLa細胞から得られた
細胞外小胞の表面形状、分泌反応、細胞取り込み能力は
無傷の細胞と同等です。
外因的に加えられた可溶性因子は
Multivesicular endosomes(MVEs)の中に導入され
細胞外領域へのその後の分泌が再封鎖されたHeLa細胞内で生じました。
加えて、
miRNAはMVEsへ輸送され、
細胞外小胞へのmiRNA封入は
RNA結合タンパク質によって制御された特定の生理経路の後に
生じました。
そのRNA結合タンパク質は
〇Argonaute
〇Y-box binding protein 1。
これらであり、miRNAタイプに依存します。
この細胞再封鎖システムは病気モデル細胞から放出された
病気特異的な細胞外小胞を分析する事ができます。
そこでは病理の細胞質ゾルが細胞内に導入されています。
再封鎖された細胞の細胞外小胞の形成は
細胞外小胞封入の機械的な見識を与えるための
再構築システムを生み出すだけではなく
細胞外小胞へ様々な分子を積載する事へ応用する事や
病気特異的な細胞外小胞マーカーを見つける事に役立ちます。
↓
(考察)
細胞外小胞へ任意の物質を積載できる事は
細胞外小胞を使った治療の一つの基礎となる事です。
さらに、細胞外小胞から不必要な物質を
流出させる技術があれば、さらに応用性は高まります。
特にRNA結合タンパク質が細胞質内にあるmiRNAを
エンドソームにあるエクソソームの前駆物質である
腔内膜小胞の中に引き付け、封入する機序は重要です。

//背景//ーー
マイクロベシクル、アポトーシス小体、エクソソームを含む
細胞外小胞は環境に依存した様式で細胞によって放出されます。
マイクロベシクル、アポトーシス小体は
細胞膜の直接的に萌芽、突き出しによって形成、
細胞外へ放出されます。
一方で、
正規のエクソソームはもっと複雑で、制御性のある機序で
生成されいます(2,3)。
初めに後期のエンドソーム膜が腔内膜小胞(ILVs)を形成するために
multivesicular endosomes (MVEs)内へ陥入させます。
次に、MVEsは細胞膜と融合し、細胞外領域でILVsを放出させます。
ILVsの径はおおよそ100nmで
それはエクソソームとこの研究では参照されます。
細胞外小胞はドナー細胞に由来する様々な物質を含みます。
脂質、タンパク質、RNA、DNA。
これらを含みます。
細胞外小胞が細胞から放出された後、
それらは受け細胞によって取り込まれます。
直接、細胞膜と融合して取り込まれる場合、
エンドサイトーシスを通じて生じる場合、
これらがあります(4,5)。
↓
(考察)
受け細胞による取り込み過程の違いは
細胞外小胞を介した細胞間の連携が
どのように生理に影響を与えるか？に
違いを与えると考えられます。
例えば、細胞膜と直接、融合する場合には
細胞外小胞の表面(糖)タンパク質が
受け細胞の表面(糖)タンパク質に受け継がれる
という現象が起こる可能性があります。
これは生理において大きなことです。
膜融合するか、エンドサイトーシスするかの選択は
細胞外小胞が受け細胞に結合するときに関与する
受容体-リガンドペアが影響を与えると考えられます。
--
受け細胞に取り込まれた細胞外小胞によって
輸送された積載物は受け細胞の生物化学的環境を
変化させ得ると考えられます。
〇信号変換経路
〇代謝経路
〇遺伝子改変(4)
これらに影響を与える事によって生じます。
これらの経路は
〇癌の進行
〇代謝性疾患
〇神経疾患
〇老化
〇感染症
これらの原因となります(6)。
様々な細胞外小胞の機能は
〇生成効率
〇被膜構成物質(膜材料、表面リガンド(受容体)など)
〇積載物質(脂質、タンパク質、RNA、DNAなど)
これらに依存します。
それゆえに
細胞外小胞の形成、分泌に関与する生理機序を理解する事は
それらを治療に応用する、病気の診断に利用するために
細胞外小胞を使用する上において極めて重要です。
--
miRNAは細胞外小胞の積載物の一つですが、
広範なたんぱく質を抑制し、
細胞の環境を改変させます。
細胞核内でのmiRNA前駆体(pre-miRNA)が
Drosha formによって転写、プロセスされた後、
pre-miRNAは細胞質へ輸送されます。
そこで
Dicer、an RNaseⅢファミリー酵素が
pre-miRNAの螺旋部位をへき開、
2重螺旋構造のmiRNA中間物質(miRNA inntermediate)。
これを形成します(7,8)。
Argonaute(Ago)は
RNase H-like PIWI domainを持ち、
2重螺旋構造のmiRNAに結合し、
RNA誘導型サイレンス複合体
(RNA-induced silencing complex (RISC))。
これを形成します。
これはRNAベースサイレンス機能を持ちます(9,10)。
多くの研究では細胞外小胞の形成を基礎とする
分子的なメカニズムを報告しています。
それは細胞内、細胞からの
特異的なmiRNAを含みます(11)。
〇Rab families
〇Endosomal sorting complexes
これらのような様々な分子は
〇Transport (ESCRT) machinery
〇RNA-binding proteins (RBPs)
〇Soluble NSF attachment protein (SNAP) receptor (SNARE),
これらの為、必要とされます。
これらの事は細胞外小胞の形成、仕分け、分泌に関わっています。
Argonaute 2 (Ago2)と相互作用をする(12)
RISCと
Trans-activation-responsive RNA-binding protein (TARPB)。
これらの構成物質も
miRNAが積載された細胞外小胞の形成に関与します。
--
いくつかの研究では
生細胞内での細胞外小胞の関わる
タンパク質、遺伝子の細胞内での機能について
〇特定の遺伝子をノックアウト、ノックダウン
〇主要なアクティブ/ネガティブタンパク質を発現
〇修正されたimRNAを利用
これらを実施する事を通して調べられてきました(11,13,14)。
隔離されたMVEsへの輸送物質仕分けの
細胞フリーの再構成は
異なる表現型を持つ細胞に由来する
特定の細胞外小胞群に対する
特定の仕分け機序を決定するためにとりわけ関心がありました(15-19)。
近年の超高分解能顕微鏡は細胞内で
MVEsの詳細な構造を観測する事、
MVEs内のDNA, EV関連のタンパク質の動的機序を観測する事、
これらを可能にしました(14,20)。
細胞内、細胞から細胞外小胞の形成の機械的な理解は
近年進んできています。
--
Yuki Sonoda, Fumi Kano & Masayuki Murata(敬称略)は
semi-intact cellsとevolutionary resealed cell coupling
を使って被膜と細胞内小器官の動きについて調べてきました
それは
Quantitative image-based microscopic analysis。
これによって実施されました(21)。
Semi-intact cellsは
Streptococcal toxin streptolysin O (SLO)を浸透させた
細胞膜を持ちます。
SLOは細胞膜内でコレステロールと結合し、
30nm径の細孔を形成するために重合化します。
このSLOに誘導された細孔、穴は
タンパク質、核酸、被膜非浸透性分子など
様々な物質を細胞内へ輸送する事を可能にします。
それゆえに
細胞質内の環境を変える事ができます。
それによって様々な細胞質内の現象を再構成できます。
例えば、
〇有糸分裂の間の細胞内小器官の表面形状改変
〇小胞輸送
〇細胞内小器官特異的なたんぱく質標的化
これらのような現象です(22,23)。
以前の報告では(24)、
細孔はCaイオン依存的な様式で修復され
SLOはマイクロベシクル分泌を通して細胞から取り除かれ
再び、無傷なintact cellsに戻るとされています。
これらの細胞は「resealed cells(再封鎖された細胞)」
と呼ばれます。
修正された細胞質環境を持つResealed cellsは
細胞タイプ「test tube」として使われ、
修正された細胞質依存的な細胞内イベントを再構築できます。
また生物化学的、形態学的な基礎的な機序についても
分析する事ができます(25,26)。
また、蛍光発光するmiRNAを細胞内に入れ
細胞を再封鎖することによって
細胞質依存的な転座、局在化、タンパク質との共局在化
動的機序について超高感度顕微鏡によって分析することができます。
Yuki Sonoda, Fumi Kano & Masayuki Murata(敬称略)は
このSLO導入によって可能になった細胞の細孔形成、再封鎖によって
細胞内の細胞外小胞の形成の分子機序について
調べる事に応用しています(1)。
研究チーム(1)はエクソソームの典型的なバイオマーカーである
テトラスパニンCD63陽性のMVEs, ILVsと共に
蛍光発光させたmiRNAの分布、動的機序をHeLa細胞で分析しています。
さらに
Ago-/Y-box binding protein 1 (YBX1)誘導性の
細胞外小胞の仕分け、引き寄せ機序についても決定しています(1)。
本日は、その概要、背景、結果の概要、議論、考察について
読者の方と情報共有したいと思います。

//結果//ーー
ネズミのリンパ腫L5178Y細胞の細胞質でHeLa細胞の細胞質を
再封鎖しています。
これは細胞内被膜ダイナミクスの再構築のための
利用として成功しているケースです。
これらの改変によって
細胞外小胞の形成や放出が活性化されます。
(参考文献(1) Fig.1e)
--
無傷、再封鎖された細胞外小胞の形態、
大きさの分布は大きな変化はありませんでした。
(参考文献(1) Fig.1b,c)
--
細胞外小胞保有のタンパク質は
CD63、Flotillin-1, GAPDH, Calnexin
これらの細胞外小胞マーカーは
無傷、再封鎖細胞外小胞両方で見られています。
一方
FITCに関しては
細胞質の改変の際に外因的に流入したタンパク質であり
それが強く再封鎖細胞外小胞にみられています。
(参考文献(1) Fig.1d)
--
CD63、CF568-dexの蛍光発光像による
これらの発光の共局局在化は
再封鎖されたHeLa細胞内の可溶性細胞質構成物質は
エクソソーム内に封入されている事を示しています。
(参考文献(1) Fig.2a)
--
外因的に加えられたmiR-39は
細胞、細胞外小胞両方に含まれ、
無傷の細胞、それ由来の細胞外小胞よりも
再封鎖されたそれらのほうが顕著に多いことが
確かめられました。
(参考文献(1) Fig.2c)
--
このmiR-39と細胞外小胞の分布が調べられています。
それを重ね合わせると
いくつかの重なりを見出すことができます。
腔内膜小胞の方が当然大きいため、
3つ程度のmiR-39がこれと共存している
様子が拡大されています。
(参考文献(1) Fig.2d）
--
miRNAを含むMVEの割合は時間の経過とともに
上昇してきます。
初めの30分で大きく上昇します、
(参考文献(1) Fig.3c)
--
AgoとYBX1はRNA結合性タンパク質であり、
多くのRNAと結合性を持っている事が知られています(9,10,16)。
従って、これらの働きを抑えるモノクローナル抗体を
導入し、それによって
HeLa細胞に含まれるmiRNA
miR-122, miR-34a, miR-423-3pの
腔内膜小胞への取り込みの変化を調べています。
それによると
共局在化の数が腔内膜小胞の数に対して
モノクローナル抗体を作用させた方が小さくなっています。
これはmiR-122, miR-34aで顕著で
miR-423-3pではあまり変化がみられていません。
(参考文献(1) Fig.4e)
これらの変化、感受性は
miRNAそれぞれがどの結合タンパク質と
どれくらいの結合親和性を持っているかによる
と考えられます(1,11)。
従って、いくつかのmiRNAでは
AgoとYBX1は共に腔内膜小胞への取り込みに
影響を与え、促進していると考えられます。
Agoによるこのような効果は
他の報告でも確認されています(27)。

//議論、考察//ーー
Streptococcal toxin streptolysin O (SLO)という細菌毒素
一旦、細胞膜に穴をあけて、
そこから外因的に
最終的にエクソソームに封入したい物質を導入し、
細胞内の機序を利用して
エクソソームの前駆体である腔内膜小胞に導入できると
エクソソームを使った薬剤輸送の
一つの大きなマイルストーンになります。
SLOで穴をあけて、それが修復する(再封鎖)する
という機序は利用する大きな価値があります。
Yuki Sonoda, Fumi Kano & Masayuki Murata(敬称略)も
議論(1)の中でその可能性について言及しています。
miRNAも治療に利用できる一つの大きな物質であるので
今回確認されたRNA結合タンパク質AgoとYBX1による
引き寄せは、任意のmiRNA封入に利用できる可能性があります。
また、もっと抽象的、広範な見識では
miRNAはこのような結合タンパク質に結合し
それが複合体として引き寄せられることによって
腔内膜小胞内への走化性を獲得し、
封入されるということです。
そこに一定の仕分けが存在します。
Rab families、Endosomal sorting complexes。
これらも仕分けに関わると考えられます。
これらの複雑な物質間の関わりにおいて
細胞内での時空間での理解、分析が進むと、
より直感的な理解につながると考えられます。

(参考文献)
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