細胞種特異的輸送系統を見据えたmiRNA治療について

//背景//ー
Noncording RNAsは多くの遺伝子から生成され
タンパク質をエンコードせず
遺伝子発現の制御やタンパク質の機能に関与します(1)。
そのうち
〇microRNAs(miRNAs)
〇long ncRNAs (lncRNAs)
これらは活発に研究されています。
遺伝子発現やタンパク質の機能に関与するので
複雑な生物学的プロセスに関与します。
〇免疫細胞発達、機能
〇免疫疾患
〇神経細胞発達
〇神経疾患
〇癌
これらです(2-10)。
従って、Noncording RNAsを標的とした治療は
様々な疾患の治療において有望のアプローチです(1)。
このRNAベース治療は様々な方式があります。
〇Antisense oligonucleotides (ASOs), 
〇Small interfering RNAs (siRNAs), 
〇Short hairpin RNAs (shRNAs), 
〇ASO anti-microRNAs (antimiRs), 
〇miRNA mimics, 
〇miRNA sponges, 
〇therapeutic circular RNAs (circRNAs)
〇CRISPR–Cas9-based gene editing 
これらが挙げられます(11-13)。
-
細胞種特異的輸送系統(Cell-type-specific delivery system)。
これの一つの重要なキャリア、方式として考えている
細胞外小胞は細胞間の連携媒体の機能を持つ中で
様々な細胞種特異的なmicroRNAs(miRNAs)を輸送する事が知られています(14-18)。
この方式を利用する際に理解しておくべきことは
現時点でのmiRNAsを使った治療の可能性についてです。
どのような展望を描けるか？
また現時点で抱えている課題は何か？
細胞外小胞に限らずナノ粒子も含めて
細胞種特異的輸送系統が解決できるかもしれない
従来の課題は何か？
また、それを適用する際に留意する事は何か？
その様な視点で包括的に調査することには
細胞種特異的輸送系統で多くの方の命を救い、
良好な予後を提供する経路(Roadmap)において
一定の意義を見出すことができます。
Melanie Winkle, Sherien M. El-Daly, Muller Fabbri & George A. Calin 
(敬称略)からなる医療研究グループが
総括したNoncoding RNA治療の総括を基礎として
その内容の一部、付加的調査、考察を
大切な読者の方と共有したいと考えています。

//miRNA治療//ー
miRNAベース治療は2つの利点があります(11,19,20)。
一つ目は
細胞内で自然に発生する分子であり、
人が作り出した化学物質ではないということです。
従って、それらのプロセスに対して
それぞれ所定の場所に前駆体から成熟過程まで
全ての生理機序を有していることです。
従って、下流側の標的選択性を持ちます。
二つ目は
1つのmiRNAで複数の遺伝子を標的にできることです。
従って、広範かつ特異的な反応を引き起こすことができます。
例えば、
miR-15-miR-16クラスターは
BCL-2, MCL1を含む多数の抗アポトーシス因子を抑制します。
これはアポトーシス機能に異常がある
癌細胞に対しての治療に利用できます(21,22)。
これに対して
上述したsiRNAsやASOsは単一の遺伝子にしか
影響を及ぼすことができないので、
miRNAsは複数の経路で治療する事に適しています。
しかし、逆にそれに伴うリスクもあります。
例えば、標的とする細胞以外に取り込まれることで
miRNAsのバランスが崩れ、
それによって細胞、組織の異常を引き起こす可能性があります。
その中で、正確な分析と輸送が求められます。
また、miRNAsを過剰に標的細胞に輸送する事によって
それに伴う異常が生じる可能性もあります(※)。
元々、RNA治療は
〇特異性(Specificity)※今述べた事
〇輸送性
〇安定性(tolerability)
これらに課題があります。
miRNAsは寿命が短く、すぐに分解してしまいます。
従って、それを守りながら
確実に標的細胞まで輸送するのは
少なくともいくつかの困難を伴います。
しかし、この点において
ナノ粒子や細胞外小胞などのキャリアを使った
miRNAsの輸送は利点を発揮する可能性があります。
これらの技術が成熟していくにあたり
同時にRNA治療の可能性も開けてくることが考えられます。
現時点ではRNAの治療に関しては
今述べた輸送の問題や副作用の問題で
臨床試験の多くは失敗に終わっています(Ref.(1) Table.3)。
例えば、
miR-34 mimic MRX34による
リポソームナノ粒子を使った輸送では
進行性悪性腫瘍の患者さんのフェーズⅠの治験において
重度の副作用が診られたとされています。
それはサイトカインシンドロームによります(23,24)。
従って、ナノ粒子を利用したとしても
免疫原性がある場合が存在します。
しかし
中皮腫(miR-16 MesomiR-1)(25)
ケロイド瘢痕(miR-29 mimic remlarsen)(26)
皮膚のT細胞リンパ腫(anti-miR-155 cobomarsen)(11,12)
これらにおいては
生命を脅かすほどの重度の有害性は
確認されなかったとされています。
従って、有害性が注意深く評価され、
輸送方法が改善すれば、
miRNA治療は適性を持つとされています(1)。
しかしながら、現時点において
元々、自然な輸送媒体である細胞外小胞を
輸送キャリアとしたmiRNA治療の臨床試験は
調べる限りにおいてはまだ行われていません。
しかし、細胞外小胞とmiRNAsは
癌のバイオマーカーとしても利用され
癌化とも深い関係があるため(27-29)
利用する場合には意図しない混入も含めて
miRNAsの種類、輸送先によっては
癌化を促す可能性も考えられます。
例えば、
miR-21, miR-29aはTLR8を活性化し、
IL-6, TNFを含め炎症性サイトカインを放出します(30)。
これらのmiRNAsによって活性化されたTLR8は
癌関連マクロファージの中で
化学療法の抵抗性の獲得に関与しています(31)。
-
一方でmiRNAsが病変部位で不足している場合もありますが、
それが過剰になっている場合もあります。
その場合ASOsに基づくAntimiRsが一つ選択されます。
例えば、
miR-122を標的としたAntimiRsがC型肝炎ウィルス
の治療のため臨床試験が行われています(32)。
もうひとつの選択として
miRNA spongesがあります。
このSponge RNAsは対象とするmiRNAsに対して
相補的結合性を持ち、それによって
関連するmiRNAsをブロックすることができます(32)。
例えば、
癌細胞でmiR-21, miR-155, miR181cを同時に抑制した
という実績があります(33)。
他には
Locked nucleic acid(LNA)-modified antimiRsがあります。
これは7-8ヌクレオチドの短いシーケンスで
miRNAの5'-seed領域を標的として
miRNAsの機能を抑えることができます。
しかし、短いシーケンスなので
正確な輸送が難しいとされています(1)。
しかし、動物のいくつかのケースで
成功しています(36,37)。
-
上述したようにmiRNAsは免疫細胞に働きかけ
免疫原性が生じる可能性があります。
その予測が難しく、
臨床前試験でのスクリーニングは
広範に行う必要があります。
また、動物と人では異なる事を考慮しなければなりません。
もし、miRNAベース治療が非常に効果があれば
逆にそれに伴うリスクも考慮する必要があります。
つまり「諸刃の剣(two-edged sword)」です。
この際には、iPS細胞技術などを用いた
患者さんを含めた人の細胞での
免疫応答について細かく調べていく必要があります。
また、人の細胞を
動物に異種移植して調べるという事も考えられます(34)。
臨床試験を行う際には
個別の患者さんごとの臨床効果、副作用の偏差についても
考慮する必要があります。
-
miRNAsはmiRBaseによれば
3000種類以上、人のケースで確認されています(35)。
この事は、人の身体の中のmiRNAsと
mRNAsのネットワークは非常に複雑であり、
特定の細胞種に対して異常なmiRNAsを検出する事や
miRNAsを輸送して、治療効果を得る事の
難しさを示唆しています。
-
miRNAsを使った治療としては
組み合わせ治療が考えられます。
例えば、
miR-155は肺癌において
化学療法の顕著な抵抗性に関係しているとされています。
従って、抗がん剤と
anti-miR-155を組み合わせて使う事によって
抵抗性を抑えながら、抗がん剤によって
癌細胞を縮小させる事ができる可能性があります。
動物と試験管で試されています(38)。
一方で、
薬剤や化学療法に対して感度を上げるような
miRNAsもあります。
miR-34aは
〇Erlotinib
〇EGFR-specific tyrosine kinase inhibitor 
〇放射線
これらに対して感度が高まります(39,40)。
従って、
細胞種特異的輸送系統のナノキャリアで
miRNAsと薬剤を同時輸送することができれば、
感度が上がった状態で精密に輸送される可能性があるので
より少ない副作用で癌治療を行うことができるかもしれません。
このmiRNAsとその他の併用療法において
細胞外小胞やナノ粒子を使った治療は
相乗効果をもたらす可能性があります。
しかし、これも諸刃の剣であり、
輸送に失敗すると逆効果が大きくなります。
確実に標的細胞まで輸送する必要があります。
実際にナノ粒子を使った併用療法についての
研究はマウスのモデルで進められています(41)。
一方で
このような胞による輸送媒体ではなく
trasferRNAとの結合性(?)を利用した
miRNAsの同時輸送が検討されています(1)。
-
miRNAsを標的とした治療は
それが自然に体の中にあるものなので、
過少、過多の中で
程度を持たせて制御することができます。
過少の場合はmimicも含めて
miRNAsを輸送する事が第一に考えられます。
一方で、過多の場合は
特定のmiRNAsを減らす必要がありますが、
Melanie Winkle(敬称略)らがFigure,1に示すように(1)、
DNAによる前駆物質の生成から
成熟、相補まであらゆる過程で
その経路に介入する余地があります。
前駆体のプロセスを含めて
低分子抑制物質が探索されています(42-44)。
それぞれのmiRNA特異的なので
特定のmiRNAsの機能を選択的に抑える事ができます(1)。
例えば、前駆物質miRNAsはペプチド核酸と
結合性が高いので、それを利用することもできます(1)。
-
miRNAsはmRNAsに結合して
遺伝子発現の制御をおこなうと考えられています。
それが何らかの疾患があると
特定の転写、翻訳経路において
異常が生じていると考えられます。
従って、それを正常化させるためには
1つのベクトルとしては
miRNAsのmRNAsに対する機能を正常化する事によって
遺伝子の発現の状態を同様に正常化させることです。
しかし、
miRNAsはmRNAsと結合する「Seed sequence」に
内因性の機能があると言われています(1)。
あるいは、mRNAsではなく
他の核酸、タンパク質(1)、脂質などと
相互作用する可能性があります。
その中で意図しない機能が生じてしまう可能性もあります。
例えば、
C型肝炎の治療で使われた
anti-miR-122 RG-101のフェーズⅠBの治験において
血中のビリルビンが高まったことによる副作用で
治験が中止されたということがあります。
おそらく好ましくないオンターゲット効果が
生じたと考えられますが、
詳細な分子機序についてはわかっていません。
また、
静脈注射など全身に投与される場合には
免疫細胞などに取得されることによって
オンターゲット効果が生じることがあります(45,46)。
従って、
直接患部に投与するという手段の他には
血液中で血中にある細胞に取得されないような
輸送媒体を選ぶ必要があります。
ナノ粒子の場合は大きさを最適化して
PEGコートして、結合分子先端を最外周に置くことで
面(エンベロープ膜表面)ではなく点での接触を可能にし、
表面での相互作用を小さくするなどが考えられます。
細胞外小胞を選ぶ場合においても
免疫細胞に取得されにくい
リソース細胞、小胞(大きさ)
装飾する表面リガンドを選ぶ必要があります。

//miRNA輸送媒体//ー
輸送性の課題においては
上述したように解決のためいくつかの選択肢があります
〇脂質ナノ粒子
〇ポリマーナノ粒子
〇GalNAs-RNA複合体(抗親和性リガンド)
〇抗体-RNA複合体
〇細胞外小胞(主にエクソソーム)
〇ウィルス粒子
〇バクテリオファージ
〇バクテリアミセル
これらが挙げられています(1)。
エクソソームについては
上述したように元々miRNAsの輸送媒体であり
CD47という単球の取り込みを防ぐ
表面リガンドが形成されている事から
高い輸送効率が期待できます。
また、エンジニアリングにより
薬剤と薬剤耐性を緩和するmiRNAsの
同時輸送なども行われています(47)。
しかし、ナノ粒子に比べ
量産性に課題があり、価格競争の問題で
市場に残れるかどうかの課題があります。
「off-the-shelf」
在庫があっていつでも入手可能で
ある程度共通化して
細胞培養環境が大きくなれば、
細胞分裂は指数関数的であるので
その中で価格の問題がどうなるか？
というのがあります。
一方で、
脂質ナノ粒子においては
新型コロナウィルスのワクチンで利用されており
すでに量産体制が世界的に築かれていることから
少なくとも価格の面での優位性は高いと考えられます。

//miRNA輸送媒体(細胞外小胞)//ー
上述したエクソソームを含む細胞外小胞は
懸念される免疫原性は低く、安全で
特にmiRNAsについては顕著であるとされています(48-50)。
一方で、
現時点では臨床試験はほとんど行われていません。
その理由は動物を使った臨床前試験が十分ではないからです(48)。
miRNA治療の輸送媒体として細胞外小胞を使う事は
いくつかのハードルがありますが、
その一つは狙いのmiRNAsが細胞外小胞に取り込まれる際の
機械的な現象の詳細がわかっていないからです。
それが受動的なのか、能動的なのか？
という議論があります(48)。
他方で、miRNAsの取り込みを上げる手段としては
RNAに結合するタンパク質(RBPs)を使う事が
報告されています(51,52)。
しかし、miRNAsを細胞外小胞に搭載する技術は
現時点ではまだ未熟な状態です。
従って、ここに一つ
細胞外小胞を利用したmiRNA治療の可能性を高める
研究開発の余地があります。
上述した価格にも関わる事です。
一般的に、細胞外小胞に取り込まれたmiRNAsは安定で
長い輸送距離を実現する事が期待されます(49)。
従って、miRNA治療が抱える根本的な難しさの
1つの要因をクリアする事ができる可能性があります。

//まとめ//ー
RNA治療を成功させるためには
今までにないほどの学際的なアプローチが必要になります(1)。
〇分子生物学
〇遺伝子学
〇免疫学
〇薬学
〇化学
〇ナノ技術
例えば、これらなどです(1)。
しかし、精密医療は正確な評価のための
高精度な生産技術も欠かせないため
産業界や生産技術などとの連携も必要です。

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