人の疾患における細胞外小胞の影響とそれを利用した治療

明日は日曜日です。
週に1度は休みが欲しいと思っているところで、
明日は気分転換にショッピングモールにでも行って
貯蔵している医療関係の本の読書でもしようと思っていました。
普段、目を通せない科学論文を読もうと思っていました。
それでも今の私にとっては貴重な気分転換です。
誰もいない家でこもって作業するのとは違います。
しかし、その予定は大きく変わりました。
私にとって大切な方たちが
私の気持ちを動かしてくれたからです。
ここでその気持ちにこたえなければ、
「私ではない」とすら思いました。
このような気持ちにさせてくれて
とても嬉しく思っています。
ブログでは専門家としての意見を言うべきで
このようなプライベートに関わる言論は避けるべきである
という面もありますが、
本日はそういう自分を許すことにします。
--
毎日、毎日、私が目にする科学論文の中で
小児医療、青年医療に関する報告で
気持ちが動かされることが度々あります。
記事にしたいと思うことも多くあります(5)。
しかし、今は強い気持ちを持って
自分の目標である
細胞種特異的輸送系統
(Cell-type-specific delivery system)。
これの実現に集中しています。
日本のメディアで
広島大学のある小児科医が
「もっと良い薬があれば、、、。」
というコメントを残していたのが
ずっと頭にあります。
その言葉の続きはきっと
「多くの命が救える。」
「治療中の痛みを軽減できる。」
「良い予後をお子さんに提供できる。」
というものでしょう。
アメリカ合衆国、ヨーロッパよりも
日本の小児医療において
選択できる薬が少ないという現状もあります。
そして、私の母国は日本であり生粋の日本人です。
従って、この状況を良くしたいという気持ちは強いです。
細胞種特異的輸送系統が実現して、
私が大きく貢献して、社会から力が与えられたなら
その力の全てではもちろんないですが、
多くの部分を小児医療、青年医療に注ぎたい
と小児医療の報告を見る度に思います。
従って、我慢しています。
「良い薬ができれば、きっと変えられる。」
このように思っているからです。
広島大学の小児科医の言葉を思い出します。
--
その様な背景があり、
明日、更新する際に参照する科学論文は
「妊娠女性の肥満の影響」(2)を選択するか
迷いましたが、やはり、
日本で強い技術に育てていきたい
細胞外小胞に関する報告(1)を選択する事にします。
しかし、
今日、このような気持ちを抱かせてくれたのは
日本ではなく、
アメリカ合衆国やヨーロッパの方々です。
日本人として母国を大切にするという気持ちを持ちながら
「医療を含め、自然科学には国境はない。」
という考え方も大切にしたいです。
また、人の気持ちを動かすというのにも
国境はありません。
本日は、私の気持ちを動かしてくれて感謝します。
--
Ravi Shah, Tushar Patel, and Jane E. Freedman(敬称略)
からなる医療研究グループは
人の疾患における細胞外小胞の循環について
総括しています(1)。
その内容を丁寧に一つ一つ参照させていただき
可能な限り、付加価値を読者の方に提供したいと思います。

//概要//ーー
細胞死やアポトーシスが起こる際には
細胞外の環境に細胞から小胞が放出されることは
よく知られています。
しかし、健康な細胞も通常の機能の中で
そのような小胞を放出するかもしれない
ということが認識されるようになりました。
その小胞は細胞外小胞と呼ばれますが、
研究が活発になったのはここ20年といわれます。
この細胞外小胞は
〇エクトサム
〇微小胞
〇マイクロベシクル
〇エクソソーム
〇オンコサム
これらに分類されます。
形成のプロセスや大きさによって分類できます。
これら細胞外小胞は
循環器の中で見つかり
細胞由来の分子である
RNA、タンパク質、代謝生成物を含みます。
細胞外小胞は細胞間の分子のやり取り、交換に関与します。
その中で生理的な機能に対して効果を持ちます。
また、病気の診断のためのバイオマーカーとしても
利用できます。
しかしながら、
いくつかの困難性、制限要因があります。
〇低い濃度
〇どの細胞、組織に由来しているかの判別
〇どの積載物が最も病状を反映しているかの特定
これらなどが挙げられます。
この総括論文のゴールは
細胞外小胞の簡潔な序章を提供することです。
その中で、この総括論文は
トランスレーショナル医療、臨床研究に
特別に焦点を当てます。
従って、人の病気を意識したものになります。
しかし、この分野はまだ未発達であり、
幅広い病気を網羅することは難しいです。
基礎医学を含めたもう少し詳しい報告は
他の報告に譲ります(3,4)。

//細胞外小胞とは何か？//ーー
細胞外小胞は被膜を持つ小器官で有り、
異なるタイプの分子積載物を含む
組織、細胞から放出されいます。
その分子積載物とは
RNA, タンパク質, 代謝生成物を含みます。
細胞外小胞の古典的な分類(2分するもの)は
その径(サイズ)と生合成プロセスに依ります。
例えば、
エクソソームは150nm以下の径を持つ小胞であると
定義されます。
一方で、
エクトサム、マイクロベシクルは
それ以上の大きさから1000nmまでの径を持つ
小胞をとして定義されます。
細胞外小胞の形成に関しては
エクソソームは多胞体(multivesicular bodies)から
生成され、広範囲の様々な細胞種から放出されます。
現存している報告では
このサイズを基礎とした定義に依りますが、
近年の専門家の意見の一致(Consensus)では
生合成や内容物の違いが分類に関係するかもしれない
と認識され始めています(6)。
現在では
これらの放出に関わる細胞外小胞の生合成
細胞内の生理信号の機序に関して
継続的な研究が行われています。
これらの基礎医学、基礎生物学に関わる内容は
Ravi Shah, Tushar Patel, and Jane E. Freedman(敬称略)
が示す総括では対象外となっています。
彼らは臨床を前提に考えた、
トランスレーショナル医療、臨床との
細胞外小胞の関わりについて総括しています(1)。
その中で
生理学的、生物化学的性質のさらなる調査についての
必要性に対して警鐘をならしながら、
循環器に存在する細胞外小胞を多様な視点で述べます。

//生理学的な機能のバイオマーカーと疾患//ーー
正常な循環器系では、
多数の細胞外小胞が血小板や巨核球から
生じているかもしれません(7)。
他方で、ほとんどの細胞は細胞外小胞を放出する
と考えられています。
細胞外小胞は血液に加えて
他の多くの生体液中に存在します。
例えば、
母乳、唾液、尿、脳脊髄液などです。
他には胸膜液、腹水、精液、汗、涙などもあります。
それぞれ組織や臓器と関連の深い生体液があるため、
それぞれの生体液に存在する細胞外小胞は
ある程度の臓器、組織特異性を持っていると考えることができます。
--
細胞外小胞は内容物として
タンパク質、脂質を含む代謝生成物、核酸を含みます。
これは放出されたドナー細胞の性質、機能を反映している
かもしれません。
参考文献(1)図1を参照してください。
エクソソームにおいては
(表面マーカー)
Integrins
CD81 and CD9 
HSPA8 and HSC70
(内容物)
Proteins
MHC I and II
Lipid rafts
Targeting and adhesion proteins
mRNAs 
miRNAs
circRNAs
IncRNAs
これらを含みます。
マイクロベシクルも内容物に関して類似します。
従って、免疫系の抗原提示にも関わるし、
多くのエピジェネティック因子も輸送します。
またインテグリンなどによって
細胞外マトリックスや組織に吸着する能力もあります。
一方で、
自然な機序でこれら多様な物質を輸送することができますから
潜在的にはこれらの物質と類似し、
かつ薬理性を持たせた物質の輸送媒体として利用できます。
多様なRNAを輸送する事ができる為
標的型RNA治療に応用することができます。
図で示されている様に表面には多様な表面リガンドがある事から
これらを管理、エンジニアリングする事に寄って
特定の細胞種、組織への輸送効率を高めることができる
可能性があります。
細胞種特異的輸送系統を実現するため、
細胞外小胞は一つの輸送媒体としての選択肢となります。
また、細胞外小胞と細胞は
膜融合する事もできる可能性がある事から(8)
細胞間の内容物の輸送だけではなく
表面リガンド、受容体も細胞との膜融合の中で
伝達している可能性も示唆されます。
--
循環器の中での細胞外小胞の機能は
継続的に調べられています。
細胞外小胞はタンパク質、RNAを通して
細胞間のコミュニケーションの機能を持っているかもしれません。
これは免疫機能(9)、炎症(10)、
病気特異的な生理経路、臓器特異的な生理経路など
身体全体の生理経路に関する効果を伴います。
細胞間の信号、細胞間のコミュニケーションの
観点で考えると
病気の診断、検出、予後診断、管理のための
非侵襲的なバイオマーカーとしての
潜在的な役割に対する関心は高まってきてます。
元々、細胞外小胞はバイオマーカーに関する研究が
多いという筆者の印象があります。
治療の為の薬剤輸送の観点だけではなく
今まで積み上げれてきたバイオマーカーとしての価値、
あるいは化粧品、農業、植物による海山陸の保全など
産業としての価値、
それら包括的な事を全て歓迎して、
協調しながら進めていくことで、
課題である管理された生産性の課題の解決にも
関わってくると考えられます。
様々なノウハウは一致する部分もあります。
--
しかしながら、
臨床的な応用をするにあたって
上述した関心を弱めるいくつかの課題、制限要因があります。
ただ、考えられる様々な課題も
上述したように細胞外小胞の応用のすそ野を広げていき、
その相乗効果を高める事で
一部乗り越えられるものがあると考えています。

//癌//ーー
細胞外小胞のは
癌生成、転移、
化学療法耐性、癌免疫など
癌形成、治療に関わる様々な因子と関わりがあります。
その中で癌生物学の中での
細胞外小胞の研究は広がっています。
細胞外小胞は胞内、活性な流出機序を伴う
バルク輸送を通した癌細胞外の
化学療法媒体となりうるとされています(11,12)。
そのことは薬剤を含む生物学的物質を
悪性細胞から遠ざける分子を放出する場合も
あるかもしれません。
例えば、
乳がんにおける
Human epidermal growth factor receptor 2[HER2]。
これなどです(13)。
卵巣がんでは細胞外小胞によって
体細胞と癌細胞の中での細胞間相互作用において
microRNA21が輸送される可能性があります。
これは化学療法の抵抗性を誘発します(14)。
従って、このような事実が確認されたなら
このmicroRNA21の働きを抑制する物質を
癌細胞に特異的に輸送する事によって
化学療法の効果を高める事ができる可能性があります。
その時に、標的化ができているのであれば、
化学療法に使う薬剤も一緒にmiRNA抑制物質と
同時に輸送する事を考えます。
例えば、GLP1アゴニストとtesaglitazarを
２型糖尿病の治療の為、リンカーにより結合して
「同時輸送する」ことで
マウスのケースですが、
肥満とグルコース代謝が改善したという報告もあります(15)。
抗体薬物複合体の例ももちろんのことですが、
標的性のある輸送媒体、細胞外小胞などを使って
薬剤耐性を防ぎながら、化学療法を
同時輸送で行う事の人のケースでのメリットは
将来的に証明される可能性はあります。
--
細胞外小胞は上皮間葉転換に関与する
分子を内的に持つことによって
転移を促す効果もあるかもしれません(16)。
また転移のための標的組織を用意する
つまり癌微小環境を作る事もあります(17)。
乳がん細胞由来の細胞外小胞は
microRNA仲介の遺伝子サイレンシングのために
必要なたんぱく質を含んでいます。
それが悪性細胞ではない正常な細胞の
性質を変えてしまうかもしれません(18)。
つまり、乳がんが存在し、
そこから細胞外小胞が放出される事に寄って
周辺の、あるいは遠い組織の正常な細胞に
細胞外小胞による連携を通して
悪影響を及ぼしてしまう可能性があるという事です。
--
癌細胞由来の抗原を持つ細胞外小胞は
親癌細胞から由来するかもしえないという根拠に
基づいて、研究者は
細胞外小胞を急性骨髄白血病を持つ患者さんの
血液から細胞外小胞を分離しました。
それでこれらの細胞外小胞は
免疫機能においてそれに関わる分子の発現を
変える事に影響を与えるかどうかについて
評価しています(19)。
この知見は癌生成、治療反応の様々なステップで
細胞外小胞が関与していることを暗示し、
その時々の癌特有の病理、病状において
機能的な役割を果たしているかもしれないことを
示しています。
--
研究に参加した人々は
癌治療の診断、予後、治療において
細胞外小胞がどのような役割を担っているかを
明かにする事を目的に集められ、
研究がスタートしています。
卵巣がんでは
癌表面のマーカーに基づいた腫瘍組織にからの
細胞外小胞の循環器中の量は
癌のステージに比例する事が示されています。
健康な人よりも量が多くなっています(20)。
加えて、
細胞外小胞とその積載物は
様々な癌種に対しての診断、予後管理戦略の
一部として調べられました。
それは
肝胆道、乳房、肺、胃腸、皮膚
前立腺、鼻咽頭、
これらにできる癌を含みます(21-31)。
これらの挑戦的な取り込みは
それぞれの癌に関連のある
複数の生体液中の細胞外小胞に含まれる
バイオマーカーの発見に焦点を当てています。
それは
大腸がんのタンパク質(32)
前立腺がんのmicroRNAs(33)
膀胱がんのタンパク質(34)
脳腫瘍のmicroRNAs(脳脊髄液)(35)
これらをそれぞれ含みます。
細胞外小胞の特異的な分子は
診断と癌ステージと関連性があります。
例えば、
食道がんのmicroRNA21(36)。
--
癌細胞の増殖、発展の病理、生理学的に
影響を与えるこれらの潜在性の観点から
細胞外小胞は
癌治療の新しいモードの一部として
今、活発に調べられているところです(37)。
特異的かつ継続的な献身は
抗癌性を持つ免疫機能を促すための
細胞外小胞の利用も含みます(38)。
あるいは
小分子の輸送のための輸送媒体として
利用する事も含みます(39)。
特異性の為の基礎的、かつ臨床的な調査と
細胞外小胞のオフターゲット効果は
臨床応用される前に
精緻な様式で調べられる必要があります。
例えば、
細胞外小胞の仕分け、サイズ管理、
表面リガンド、受容体の管理、
内容物の管理、
これらなどは生体内で影響を与える因子であるため
最先端の技術を駆使して、
多様な様式で品質管理する必要があります。
また、何を含ませればいいかという理解のための
基礎的な細胞外小胞の研究も必要です。

//心血管代謝性疾患//ーー
心臓血管、代謝性疾患の細胞外小胞の機能は
癌に対する特徴と共有できる部分があります。
細胞外小胞によって仲介された
心臓の異なる細胞種間の相互作用、クロストークの
証拠が生まれています。
例えば、
アンジオテンシン2が心臓線維芽細胞から
細胞外小胞の放出により引き出されています。
それは心筋細胞内の遺伝子発現を改変する事を通して
心臓肥大を引き起こしうるとされています(40)。
加えて、
マクロファージ由来の細胞外小胞に含まれる
microRNA155は線維芽細胞増殖を減少させ
マウスのケースで炎症反応を高めました(41)。
この事は心筋細胞以外の細胞種の
細胞外小胞を介したクロストークが
心臓の組織学的な構造に影響を与えるかもしれない
ことを示しています。
拡張型心筋症を持つ患者さんから得られた
循環器にある細胞外小胞は
培養環境内で病理に関わる分子表現型を
心筋細胞に輸送する事を示しました(42)。
これは癌で確認された病理に関わる分子を
細胞外小胞が輸送する機序と類似します。
--
人のケースにおいて
心臓血管疾患を持つ患者さんでは
循環している細胞外小胞の数が増加する事が示されています。
その疾患とは心不全などです(43)。
ほとんどの現在進められている
コホート研究は血漿から
直接、代謝生成物、タンパク質、転写物質の
分析に焦点を当てています。
一方で、これらのバイオマーカーを
定量化するための細胞外小胞の分離は
診断のための新たな領域です。
血漿中の循環エクソソームの濃度は
心臓トロポニンの循環レベルと比例関係にあります。
冠動脈バイパス手術の後
24～48時間の間で上昇します(44)。
循環している細胞外小胞の量は
心臓血管疾患のリスク因子と関連があります。
またその長期的な予後にも関連があります(45,46)。
心臓移植を受けた人の
循環している細胞外小胞のタンパク質の研究は
免疫機能に関わるいくつかのタンパク質の存在を
急性の拒絶反応を持つ患者さんにおいて確認しています(47)。
心筋梗塞後の心不全の有無を持つ患者さんの
ケースコントロール研究では
心不全や左心室リモデリングの予後と関連のある
いくつかのmicroRNAは循環している
細胞外小胞の中において豊富に含まれていました(48)。
--
細胞外小胞内のタンパク質発現の調査は
急性冠動脈系心疾患に関連する
いくつかのタンパク質を明らかにしました。
そこには
免疫グロブリン受容体、
シスタチンＣ、補体なども含まれていました(49)。
心筋梗塞を持つマウスでは
心臓前駆細胞から由来した細胞外小胞の
梗塞領域周辺への注入は
その後の組織改変を緩和しました。
前駆細胞の注入後の結果と類似します。
例えば、
外科的にアクセスしにくい心臓、心臓血管の
任意の細胞種が損傷を受けて、
創傷治癒が必要な場合、
前駆細胞から放出される細胞外小胞を
その細胞種に特異的に届くように
エンジニアリングして、回復を促す
ということが可能かもしれません。
--
細胞外小胞の利点は
心筋細胞や心筋線維症に対する効果にある
と考える事ができるかもしれません(50,51)。
--
心臓血管疾患に類似して、
心臓代謝系疾患(肥満)は循環している微粒子の
数が多くなることが示されています(52)。
マウスモデルによる近年の研究では
脂質組織からの細胞外小胞は
肝臓の遺伝子発現を
noncoding RNAsに依存した様式で
改変することを示しています(53)。
このことは
長距離の臓器間のコミュニケーションが可能な
細胞外小胞の潜在的な病理を暗示します。
microRNAsを含めたnoncording RNAsは
細胞外小胞が活発に輸送する物質の一つなので
それに依存して遺伝子が変わる事は
さらに細胞外小胞の関与を裏付けます。
--
これに関する臨床的なデータは
まだ多くは示されていませんが、
糖尿病、肥満、心臓血管疾患の間の
重要な関わりを示しています。
例えば、
糖尿病の患者さんの細胞外小胞の
microRNAにおいては
microRNA 126, 26aが減少することが知られています。
これは血管内皮細胞から放出されています。
これは心臓血管疾患と関連があるかもしれません(54)。
逆に
低血糖に対する直接的な治療は
循環する細胞外小胞を改変する事にあるかもしれません。
肥満手術を受けた患者の小さな研究では
インスリン抵抗性における
手術後のシフトは
インスリン信号に関わる細胞外小胞内にある
microRNAsの変化が関わるとされています(55)。
まだ、動物モデルから人へ
トランスレーショナル医療が十分に
進んではいませんが、
細胞外小胞が心臓血管疾患や心臓代謝性疾患の
機能的バイオマーカーとして働きうることを
提案しています。

//神経疾患//ーー
癌や心臓血管疾患と同様に
神経変性、トラウマ、脳卒中など
神経疾患に対して、
研究者は細胞外小胞の潜在的な役割を明らかにする事に
関心を集めてきています。
トラウマ性脳損傷のモデルでは
マイクログリアからの細胞外小胞内の
microRNA 124の増加が
炎症の減少や損傷後の回復のための再成長に
関わっている事を示しています(56)。
脳卒中のモデルの中で
間質細胞からの細胞外小胞に含まれる
microRNA133bは神経構造の改善に関与している
かもしれないとされています(57)。
従って、
このような回復に関わるmicroRNAを
損傷を負っている領域特異的に輸送できるように
プログラミングした細胞外小胞を輸送媒体として
輸送する事で、治療の一環として
神経組織の回復を実現できる可能性があります。
--
細胞外小胞が病気と健康の間の表現型の移動、
つまり健康から病気にどのように移り変わるか
またその逆はどうか
といったことに関わるかもしれないとされています。
細胞外小胞は認知症の治療にも利用できる
可能性があります(58)。
--
新たな研究は神経認知疾患の
細胞外小胞の輸送物質の役割について
その価値を提案しています。
リン酸化されたタウタンパク質は
初期のアルツハイマー病の脳脊髄液の
細胞外小胞と関連があります(59)。
またタウを含む細胞外小胞は
アルツハイマー病において
機械的に重要な役割を担っているかもしれません(60)。
シナプス性の生理学的な機能に
直接関与する鍵となるたんぱく質の改変された発現は
アルツハイマー病の大人の患者さんの
認知機能と直接的な関連があります(61)。
そのたんぱく質は細胞外小胞の中に見つかっています。
細胞外小胞がバイオマーカーとして優れているのは
他の癌や心臓血管疾患も同じですが、
その小胞内に収納されることによって
酵素による分解から守られる事にあると想定しています。
従って、遊離しているバイオマーカーを
分析するよりも比較定量的に優れている
ということは言えるかもしれません。
--
これらの細胞外小胞内のタンパク質を分析する事によって
臨床的な診断がつく数年前からリスクを洗い出す
ことができる可能性があるとされています(62)。
--
血液からの細胞外小胞の
次世代RNAシーケンスPCRアッセイは
アルツハイマー病で機能不全を示している
16種類のmicroRNAsを明らかにしました(63)。
加えて
脳脊髄液からの細胞外小胞に含まれる
特異的なmicroRNAは
異なる神経認知疾患において特異的かもしれません。
例えば、パーキンソン、アルツハイマー病です(64)。
これは大きな研究においても
診断として応用できる可能性を示しています。
1つの研究では
タウタンパク質を含む細胞外小胞の
循環量は健康な群より
脳の衝撃を度々経験する
アメリカンフットボール選手に多いとされています。
これはこれらの選手が認知機能が
低くなる傾向と関連があります(65)。
また、慢性トラウマ性脳症に生じる
認知障害でも同様です。
これらの結果は循環している
神経細胞由来のエクソソームの
診療現場での検出の観点からとりわけ
医療的な価値を見出すことができます。
実際に脳震とう性の損傷でマウスのケースでも
変化が生じています(66)。
癌治療と類似する様式で
神経変性疾患に対する細胞外小胞を使った
治療が急速に発展してきています。
例えば、
βアミロイド蓄積の生成に関わる
酵素の発現を改変させる
siRNAsを含む細胞外小胞のエンジニアリングです(67)。
細胞外小胞を使った治療は
表面リガンド、受容体の探索、形成技術が
進めば、また一段エンジニアリングの水準が
向上することになります。

//感染症//ーー
ウィルスはいくつかの目的のために
細胞外小胞の細胞機能を利用します。
それは感染性を上昇させたり、
免疫逃避の機能を獲得することも含みます(68)。
Ｃ型肝炎ウィルスに感染した
ヘパトーマ細胞由来の細胞外小胞は
ウィルスと標的細胞の活性な相互作用の欠如の中で
感染を促進する遺伝子情報やタンパク質を含みます。
さらに
この細胞外小胞仲介の感染は
抗体を介した免疫によるウィルス排除の機能から
逃れるかもしれません(69)。
--
バイオマーカーから
細胞外小胞の表面状態や量は
ウィルス感染の活性と関わりがあります。
HIV-1に感染した人では
循環している細胞外小胞のサイズと量が
CD4/CD8 T細胞(比)と反比例するといわれています。
つまり、CD4レベルが下がると
細胞外小胞のサイズと量が増えるという事です。
HIV-1感染の制御は
細胞外小胞の表面状態、その特徴と関連があります(70)。
さらに
抗レトロウィルス療法による治療は
細胞外小胞内の
microRNA155、microRNA223の量の減少に関連があります。
この事は
細胞外小胞の内容物が
治療の反応の分子信号と関連がある事を示しています(70)。
細胞外小胞の感染力は
プリオン病に拡張することができます(71)。
この疾患では病原性の非融解性conformerへ
転換されるプリオンタンパク質を生む
細胞外小胞が病気を伝染させます(72)。
治療、早期検出、感染経路追跡のための
バイオマーカーとして
細胞外小胞のさらなる研究が求められます。

//挑戦的な課題//ーー
細胞外小胞の基礎、臨床、トランスレーショナル
研究の研究開発に関わる関心は
いくつかの国際機関の設立によって
高められてきました。
例えば、
The American Society for Exosomes and Microvesicles and the International Society for Extracellular Vesicles
これらは細胞外小胞の研究、バイオマーカー発展のために
標準的な手順、プロトコルを作成しています(73)。
このような高い関心にも関わらず
主要な技術的、生物学的な挑戦的な課題への対処は
まだ発展途上、黎明期にあります。
--
どの様に細胞外小胞を形成するか？
どの様にドナー細胞を追跡するか？
細胞外小胞がいくつく先はどこか？
こういったことが課題になります。
人への応用を考えた時
それぞれの病気に最適なバイオマーカーを
どうやって見つけるか？
といったこともあります。
--
例えば、
人の生体液から
細胞外小胞を分離、性質分析するための
標準化の方法がありません。
このことは世界で共有される細胞外小胞に関連する
報告の信頼性に関わります。
なぜなら、ある素晴らしい成果を上げた研究を
他の研究所で再現しようとしたときに
標準的なプロトコルが細かく設定され
それが明記されていないと、
異なる条件で実験する事になります。
細胞外小胞が非常に繊細な特質を持っているならば
再現性に関する大きな問題が生じても不思議ではありません。
--
加えて、臨床因子の影響に関する
情報も欠落しています。
例えば、年齢、性別、人種などです。
また血液から採取できる細胞外小胞も
採取できる血液量に制限がある事から、
信頼性を得るために十分な量を確保できるかは
不透明です。
--
細胞外小胞を分離するためのいくつかの方法があります。
例えば、
〇Density gradient centrifugation
〇Antibody affinity columns,
〇Precipitation–ultracentrifugation 
これらが世界共通的な方法です(74)。
Density gradient centrifugationは
遠視分離するステップを組み合わせて
細胞外小胞をサイズ別に分離する方法です。
しかし、時間がかかるとされています。
また、量や熟練性も必要です。
従って、
臨床現場で採用するとなると
少なくとも多くの自動化、効率化が必要になります。
抗体を使った方法では
表面たんぱく質に依存して分類します。
細胞外小胞の表面タンパク質は異種性が高いため
それに依存した分類によって
上手く仕わけられるかが不透明です。
それぞれの細胞外小胞だけではなく
患者さんごとのばらつきもあります。
しかし、
高いスループットを持つ
優れた遠心分離機により
細胞外小胞を分離する事に寄って、
「off the shelf」
つまり在庫を持つことが可能になり、
この事は臨床現場での採用や
バイオマーカー発見のための
トランスレーショナルな取り組みに
繋がる可能性があります。
しかし、ゴミの流入や価格の問題があります(75)。
--
加えてサイズや表面状態を分析する
いくつかの方法があります。
例えば、
〇Flow cytometry, 
〇Atomic force microscopy
〇Particle-tracking technology
これらです。
--
少量から分離を可能にすることは
細胞外小胞を使ってバイオマーカーを分析するためには
必要不可欠です。
いくつかの基準を作る事が大切です。
しかし、こうした優れたノウハウは
細胞外治療を用いた産業の
利益の源泉となるため
それを価値に応じて確保しながら、
どのように基準を作るかというのは
1つ難しい命題です。
その中で知的財産管理は一つの考え方です。
--
一般的なバイオマーカーの妥当性に関連する
臨床因子は細胞外小胞の配置と内容物に関して
影響を持つかもしれません。
例えば、
細胞外小胞の収集、分離のための時間は
特性に影響を与えるかもしれません。
細胞外小胞を放出する血小板による
ベースラインの揺らぎも考えられます。
--
どの細胞から放出された細胞外小胞かを
識別する事は非侵襲的な分析においては欠かせません。
生体液を適切に選択する事で
その精度が上昇する可能性がありますが、
細胞種ごとのより精巧な分析を目指すにあたっては
細胞種特異的な表面マーカーを
見つける事が重要です。
この細胞種特異的な表面タンパク質を
人の全身で地図的に明らかにしていく事は
（Surfaceome)
非常に骨の折れる作業ですが、
細胞外小胞を使ったバイオマーカーの診断制度を
上げる事だけではなく、
細胞種特異的輸送系統を使った
様々な媒体での治療にも貢献します(76)。
細胞表面タンパク質が細胞外小胞とどのような
関わりがあるかというのが明らかになれば、
細胞種の表面タンパク質の解析が生きてきます。
--
細胞外小胞だけはなく、
ナノ粒子、ジェル、直接的なリンカー、
これらなどでも適用可能です。
臨床応用する際には
確率的な分離になると思いますので
機械学習なども組み込んだ自動化されたシステムが
導入されることになるのではないか
と想定されます。
しかし、そうするとコストの問題が
やはり浮上してきます。
良い装置が生まれたら、
地域でシャアすることも想定内になります。

//臨床実践に関する影響//ーー
人の疾患の新しく見つかったバイオマーカーは
病理を反映し、医療介入を変え、
現状の診断を超えて診断、予後の管理における
付加価値を提供する必要があります。
細胞外小胞は病気において
機能性を持つかもしれませんが、
それが上述した臨床実践の中で
本当に付加価値を持つかどうかは明らかではありません。
しかし、
細胞外小胞の内に含まれるmicroRNAや
細胞外小胞の量、サイズが
病状と比例、反比例するデータもあるので
それによって
進行の度合いを診断する
1つの大切な評価項目になる可能性はあります。
他の従来の診断、検査と組み合わせることで
信頼性を上げる事につながるかもしれません。
また、
将来的には今行われている
細胞外小胞と病気の関連の研究が
治療に応用されることも期待されます。
例えば、
標的細胞のmicroRNA量を適正に調整するなども
考えられます。
また、患者さんの大切な今後の人生において
1つとても大切な予後の管理においても
細胞外小胞を利用した診断、治療、管理が
付加価値を生む可能性もあります。

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