微小管の動的機序、構造、機能

微小管(Microtubule)は、チューブリンと呼ばれるタンパク質の重合体です。
細胞骨格の一部を形成し、真核細胞に構造と形状を与える役割を果たしています。
微小管の長さは最大で約50マイクロメートル(3)、
直径は23～27ナノメートル、内径は11～15ナノメートルです(1,2)。
微小管は、2つの球状タンパク質、
アルファチューブリン、ベータチューブリン。
これらの二量体が重合して原線維(プロトフィラメント)を形成し、
その後、側面で結合して中空の管状構造である微小管を形成します。
一般的な微小管の形態は、13本の原線維が管状に配置された構造です(4)。

微小管は真核細胞における細胞骨格フィラメントシステムの1つであり、
その表面を移動するモータータンパク質(キネシン、ダイニン)によって、
細胞内での双方向の物質輸送に関与しています。
微小管は、さまざまな細胞過程において重要な役割を果たしています。
微小管は、細胞の構造を維持する役割を果たし、
アクチンフィラメントや中間径フィラメントと共に細胞骨格を形成します。
また、繊毛や鞭毛の内部構造を構成しています。
上述したモーターたんぱく質による微小管は細胞内輸送のための
プラットフォームを提供し、大きな構造体である
分泌小胞や細胞小器官、細胞内の高分子複合体の移動などを含め、
さまざまな細胞過程に関与しています(5)。
また、中心体(Centrosome)から伸びる微小管は娘細胞に分離される
2つの中心体から伸びる紡錘糸(spindle fibers)の材料であり、
染色体など細胞の機能において極めて重要な物質の配置や
分裂の為の細胞にくびれ形成などにも関わります。
このように細胞分裂(有糸分裂や減数分裂)にも関与しています。

微小管は、中心体(多くの動物細胞の中心に見られる)、
繊毛や鞭毛の基底小体(6)、または多くの菌類に見られる紡錘極体など、
微小管形成中心によって核形成され、組織化されます。

微小管には、多くの結合タンパク質が存在します。
その中には、モータータンパク質であるダイニンやキネシン、
微小管切断タンパク質であるカタニン(8)、
(脱)重合体化による(7)微小管動態を調節する重要なタンパク質が含まれます。
最近、グラム陽性菌であるBacillus thuringiensis(バチルス・チューリンゲンシス)で、
プラスミドの分配に関与するナノチューブルと呼ばれる
微小管様構造を形成するアクチン様タンパク質が発見されました(9)。
他の細菌微小管は、5本の原線維で構成されるリング状構造を持っています(10)。


チューブリンや微小管を介したプロセス(例えば、細胞の運動)は、
17世紀にすでに顕微鏡で観察されています。
しかし、鞭毛や他の構造の繊維状の性質は、
改良された光学顕微鏡によって2世紀後に発見され、
20世紀には電子顕微鏡と生化学的研究によって確認されました。

ダイニンやキネシンといった微小管モータータンパク質の
in vitro(試験管内)アッセイでは、微小管に蛍光標識を付け、
微小管またはモータータンパク質のいずれかを顕微鏡スライドに固定します。
その後、スライドをビデオ強調顕微鏡を用いて観察し、
モータータンパク質が微小管に沿って移動する様子、
または微小管がモータータンパク質上を移動する様子を記録します(11)。

これにより、微小管を介したプロセスの一部は、
キモグラフ(kymograph)を使用して特定することが可能になります(12)。
キモグラフとは時系列の空間位置を描くアナログデバイスです。


真核生物において、微小管は重合した
α-およびβ-チューブリン二量体からなる長い中空の円筒です(13)(14:Figure 1)。
この中空の微小管円筒の内側の空間はルーメン(内腔、中空)と呼ばれます。
αおよびβチューブリンのサブユニットはアミノ酸配列のレベルで
約40%の同一性を持ち(13)、それぞれの分子量は約50 kDaです(15)。

微小管の合成プロセスは確定的ではありませんが、
非常に簡略的にはα/β-チューブリン二量体は、
直線状のプロトフィラメントに末端対末端で重合し(16:Fig.3b)、
一定の湾曲を経ながら(16:Fig.3c 3d)、
側方に連結して単一の微小管を形成します。
通常、微小管は13本のプロトフィラメントが平行に連結して形成されますが、
生物種(17)、in vitro(試験管内)(18)では、より少ないまたは多い
プロトフィラメントからなる微小管が観察されています。

微小管には、重要な生物学的機能において不可欠な極性があります。
チューブリンは末端対末端で重合し、ある二量体のβ-サブユニットが
次の二量体のα-サブユニットに接触します。
そのため、プロトフィラメントでは、一方の端がα-サブユニットを露出し、
もう一方の端がβ-サブユニットを露出します。
この端はそれぞれ(−)端と(+)端と呼ばれます。
プロトフィラメントは同じ極性を持って束になります。
微小管の伸長は(+)端と(−)端の両方で起こる可能性がありますが、
(+)端での伸長がはるかに速いです(8.9 vs 4.3/μM/s(19))(16)。
従って、中心体から＋端の方向に延びるように成長していきます。

プロトフィラメントの側方連結によって擬螺旋構造が生成され、
1回の螺旋回転に13個のチューブリン二量体が含まれ、
それぞれ異なるプロトフィラメントに由来します。
最も一般的な「13-3」構造では、螺旋の回転による垂直方向のオフセットにより、
13番目のチューブリン二量体が次のチューブリン二量体と
3つのチューブリン単量体分のずれで相互作用します(20:Figure 3)。
すなわち、13本のリング構造のα、βチューブリン(サブユニットの)
それぞれの管としての螺旋形性において、
1周のリセット位置が単量体3つ分長軸方向に移動する、
そのような角度で巻かれるということです。
11-3、12-3、14-3、15-4、16-4など、他の代替的な構造も
検出されていますが、出現頻度ははるかに低いです(21)。

微小管内の側方プロトフィラメント間で起こり得る
2種類の相互作用は、A型格子とB型格子と呼ばれます。
A型格子では、隣接するプロトフィラメントの
αおよびβ-チューブリンサブユニットが隣接して相互作用します。
一方、B型格子では、あるプロトフィラメントの
αおよびβ-チューブリンサブユニットが
一定数の同種結合パターンで交互に形成されます(22:Figure 1)。
B型格子が微小管内での主要な配置であることが示されています(23)。
ただし、ほとんどの微小管には、
α-βサブユニットが相互作用する継ぎ目があります(24:Fig.1)。
β-チューブリンとα-チューブリンは非共有結合的に結合します(25)。

プロステコバクター(Prosthecobacter)の一部の種も微小管を含んでいます。
これらの細菌性微小管の構造は真核生物の微小管と似ており、
BtubA(細菌性チューブリンA)およびBtubB(細菌性チューブリンB)の
ヘテロ二量体から組み立てられたプロトフィラメントの中空管で構成されています。
BtubAとBtubBは、それぞれαおよびβチューブリンの特徴を共有しています。
真核生物の微小管とは異なり、細菌性微小管は
フォールディングにシャペロンを必要としません(26)。 
上述のように、真核生物の微小管が13本のプロトフィラメントからなるのに対し、
細菌性微小管は5本のプロトフィラメントから構成されています。


微小管は細胞骨格の一部であり、細胞質内の構造ネットワークを構成しています。
微小管の細胞骨格における役割には、
- 機械的支持(27)　- 細胞質の組織化(28)
- 物質輸送(29)　- 運動性(28,30)
- 染色体分配(31)
これらがが含まれます。
発達中のニューロンでは、微小管はニューロチューブ(neurotubules)とも呼ばれ、
細胞骨格の別の構成要素であるアクチンの
ダイナミクスを調節することが知られています(32)。
また、微小管は伸長と収縮を通じて力を発生させる能力があり、
キネシンやダイニンなどのモータータンパク質を介して、
mRNAを含む細胞内のオルガネラや他の構成要素を
微小管上で輸送することができます。
この輸送には、特定のアダプタタンパク質が関与しています(29)。
この多様な役割の組み合わせにより、
微小管は細胞内の構成要素や輸送物を組織化し移動させるために
重要な役割を果たしています。

微小管の細胞内での組織化は、細胞の種類によって異なります。
上皮細胞では、微小管ポリマーのマイナス端が細胞間接触部位付近に固定され、
頂底軸(apical-basal axis)に沿って組織化されています(33:Fig.1)(34:Figure 1)。
核形成後、マイナス端は解放され、ナインイン（ninein）や
PLEKHA7などの因子によって再び周辺部で固定されます(35)。
このようにして、微小管は
タンパク質、小胞体、オルガネラ(細胞内小器官)。
これらの頂底軸に沿った輸送を可能にします。
一方、線維芽細胞や他の間葉系細胞では、
微小管は中心体(centrosome)に固定され、
プラス端が細胞周辺部に向かって放射状に伸びています。
移動性を持つこれらの細胞では微小管が
その細胞移動において重要な役割を果たしています。
神経細胞では微小管形成中心(MTOC)を起点として軸索上に形成されます。
骨格筋細胞では細胞核数に応じて一定間隔で中心体が形成され
主に筋組織の伸縮方向に沿って形成されます(36:Figure 1)。
さらに、微小管の極性はモータータンパク質の影響を受け、
細胞内の多くの構成要素(小胞体やゴルジ体など)。
これらを組織化する役割を果たしています(37)。

中心体がどこに配置されるかは細胞の局所的な機械的特性に関与します。
免疫学シナプスではT細胞と抗原提示細胞の間で
多くの表面タンパク質が同時に結合する必要があります。
その際には中心体が結合面近くに移動し、
微小管を短い距離で連結させ、その結合を機械的に支持します。
これはT細胞が抗原認識して獲得免疫を形成する上で重要なプロセスですが、
過剰な抗原認識は自己免疫疾患につながるため、
その免疫学シナプスを抑制する機序も同時に必要です。
その抑制因子となるのが微小管の分子モーターであるキネシン4で
キネシン4は微小管の＋端で分解(Catastrophy)させる働きがあります(93)。


核形成は、チューブリンダイマーから微小管を形成する
最初の段階を指します。微小管は通常、微小管形成中心(MTOC)と呼ばれる
オルガネラによって核形成され、組織化されます。
MTOCには、微小管そのものを構成するαおよびβサブユニットとは
異なる種類のチューブリンであるγ-チューブリンが含まれています。
γ-チューブリンは、いくつかの関連タンパク質と結合し、
γ-チューブリンリング複合体(γ-TuRC)と呼ばれる
ロックワッシャー状の構造を形成します(38:Graphical Abstract)。
この複合体は、α/βチューブリンダイマーが
重合を開始するためのテンプレート、基板として機能します(39)。
γ-TuRCは微小管の(−)端をキャップとして保護しつつ、
微小管の成長はMTOCから遠ざかる(+)方向に進行します(40:Fig.1)。

中心体(Sentrosome)は、多くの細胞型における主要なMTOCです。
しかし、微小管は他の部位からも核形成されることがあります。
例えば、繊毛や鞭毛の基部には基底小体(basal bodies)というMTOCがあります。
また、ゴルジ体が微小管核形成の重要なプラットフォームとして
機能する可能性が示唆されています(41)。
中心体からの核形成は本質的に対称性を持つため、
ゴルジ体関連の微小管核形成は、ゴルジ体円弧に沿った
細胞が微小管ネットワークの非対称性形成(41:Figure 1)。
これに関わる可能性があります。
これは細胞の機械的特性の極性に関与する可能性があります。
中心体依存の紡錘体ベースの微小管生成において、
オーグミン(augmin)というタンパク質複合体が
重要な因子であることを特定しました。
この複合体はγ-TuRCと相互作用し、有糸分裂紡錘体の起源周辺での
微小管密度を増加させることが示されています(42)。
従って、微小管の核形成は個別の機能(方向、密度)に基づいて
それが成立するいくつかの条件が存在するということです。

植物細胞のように、明確なMTOCを持たない細胞型もあります(43)。
これらの細胞では、微小管は細胞質内の離散的な部位から核形成されます。
一方、トリパノソーマ寄生虫のような細胞型では、
MTOCは鞭毛の基部に永久的に存在します(44)。
この場合、構造的な役割や有糸分裂紡錘体を生成するための微小管の核形成は、
従来の中心小体様MTOCからは行われません。

初期の核形成イベントの後、成長するポリマーに
チューブリンモノマーを追加する必要があります。
モノマーの追加や除去のプロセスは、
溶液中のαβ-チューブリンダイマーの濃度と臨界濃度
(微小管末端での全体的な組み立ても分解も発生しない平衡状態の濃度)
これら関係に依存します。
ダイマー濃度が臨界濃度を超えている場合、微小管は重合して成長します。
これは結晶成長が過飽和条件で駆動されるモデルと同様です(91)。
逆に、濃度が臨界濃度を下回る場合、微小管の長さは減少します。
従って、周辺のαβチューブリンダイマー濃度は
環境中のATP、ADP濃度とは別の素因で微小管の合成、分解。
それが可能にする微小管の動的特性に関与します(45)。


動的安定性とは、微小管の端で組み立てと分解が共存する現象を指します。
これは下述するようにチューブリンがシート状に形成され、
一部、GDP結合チューブリンが露出して分解されること(94)。
これを説明するものかもしれません。
この領域では、微小管が成長と縮小の間で動的に切り替わることができます(46)。

成長端のチューブリンダイマーGTP分子を2つ結合することができ(47)、
そのうち1つは組み立て後に加水分解される可能性があります。
ポリメラーゼ中、チューブリンダイマーはGTP結合状態にあります。
α-チューブリンに結合したGTPは安定しており、構造的な機能を果たします。
しかし、β-チューブリンに結合したGTPは、
組み立て後にすぐにGDPに加水分解されることがあります(89)。
GDP-チューブリンの組み立て特性はGTP-チューブリンとは異なり、
GDP-チューブリンは分解されやすくなります(46:Figure 1)。
微小管の先端にあるGDP結合チューブリンは脱落しやすいですが(89)、
微小管の中央にあるGDP結合チューブリンは
自発的にポリマーから外れることはありません(46:Figure 1)。
チューブリンはGTP結合状態で微小管の端に追加されるため、
GTP結合チューブリンのキャップが微小管の先端に存在し、
それを分解から保護していると考えられています。
GTP結合数には重合と分解の閾値があり、それを下回ると
急速な脱重合と縮小が始まります(89)。
この時、GTP脱離と共に先端に不安定なGDP結合チューブリンが露出し、
GDP結合が外れ、チューブリンが脱離します(89:Fig3d)。
この成長から縮小への切り替えはカタストロフィーと呼ばれます(48)。
再びGTP結合チューブリンが微小管の先端に追加され、
新しいキャップを形成して微小管を縮小から保護します。
この現象は「レスキュー」と呼ばれます(48)。
すなわち、重合体化している条件では
成長端のチューブリンはGTP結合が加水分解されることなく
時間的/力学的に成立しているということです。

チューブリンが縦方向に結合するモデルは
Allosteric modelやLattice modelがありますが(89:Box.1)、
いずれにしてもベースはチューブの円周方向の圧縮応力で生じた
ポアソン比に従う成長方向の伸長応力、
すなわち、チューブリン同士が互いに押す力である。
このように定義しました。
そうすると必然的に円周方向の
チューブリン同士の結合力が相対的に弱くなります。

微小管が成長端で合成されるときには
いきなり既にチューブ状として完成している径のまま
順にらせん状に合成されていくのではなく、
中間状態としてシート状に形成される可能性が指摘されています。
これが非平衡な状態で一部、ADP結合チューブリンが露出すること(94)。
これを説明するかもしれないとされています(89)


1986年に微小管がその動的特性である成長と縮小を利用して
細胞の三次元空間を探索するという考え方が提案されました(49)。
プラス端がキネトコアや極性のサイトに遭遇すると、
それらが捕らえられ、もはや成長や縮小を示さなくなります(50;Figure 6)。
通常の動的な微小管は半減期が5〜10分ですが、
捕らえられた微小管は数時間持続することがあります(51)。
このアイデアは
探索と捕獲(Search-and-capture)モデルとして広く知られています(52)。
その後の研究は、この考え方を大いに支持しています。
キネトコアでは、さまざまな複合体が
微小管のプラス端を捕えることが示されています(53)。
さらに、間期の微小管における
プラス端キャッピング活性も記述されています(54)。
＋端に結合して微小管構造を安定化させる物質は
- フォーミン(55:Figure 4)、
- 腺腫性ポリポシスコリ(APC)タンパク質(56,57)、
- タンパク質EB1(57)
これらが少なくとも確認されています。
フォーミンは成長端で微小管から新しいアクチンフィラメント。
これの重合体化を補助する働きもあります(90)。
ECT2は成長端近くに結合し、
アクトミヨシン分割環(Actomyosin cleavage ring (AMR)）。
これの形成に関わります。
従って、細胞分裂の細胞質分割の骨組みを形成する際に
微小管はその骨組み形成に関わる物質の足場となります(89:Fig.1d)。

細胞分裂の時には染色体を娘細胞に配置する際に、
分子モーターに依存するだけではなく、
微小管の分解により、中心体の方向に向かって
微小管と結合した染色体が牽引されていきます(89;Fig.1h)。


寿命が数時間以上ある安定化した微小管は、微小管結合酵素の作用によって
チューブリンのサブユニットに翻訳後修飾を蓄積します(58)。
しかし、微小管が脱重合すると、
これらの修飾の大部分は可溶性酵素によって迅速に逆転されます。
ほとんどの修飾反応が遅い一方で(60)、その逆反応は迅速であるため、
修飾されたチューブリンは長寿命の安定した微小管上でのみ検出されます。
これらの修飾の多くは、α-チューブリンのC末端領域で発生します(59)。
この領域は負に帯電したグルタミン酸が豊富で、
微小管から突出する比較的非構造的な尾部を形成し、
モータータンパク質と接触します。
そのため、チューブリンの修飾は
微小管とモータータンパク質の相互作用を調節すると考えられています。
これらの安定した修飾微小管は、
間期細胞において通常細胞の極性部位に向かって配向しているため、
修飾微小管のこのサブセットは
これらの極性ゾーンに小胞を輸送するための特化したルートを提供します。
このような修飾には以下が含まれます：

脱チロシン化: 
α-チューブリンのC末端チロシンの除去。
この反応により、新しいC末端にグルタミン酸が露出します。
その結果、この修飾を蓄積する微小管は、Glu微小管と呼ばれます。
チューブリンカルボキシペプチダーゼはまだ特定されていませんが、
チューブリン-チロシンリガーゼ（TTL）は知られています(61)。
これにより分子モーターであるキネシンとダイニンと
微小管との相互作用が高まり(62)、物質輸送の機能強化が実現されます。
グルタミン酸の露出は成長圧を下げ、分解圧を上げる可能性があります(63)。

Delta2修飾: 
α-チューブリンのC末端から最後の2残基を除去する修飾。
デチロシン化とは異なり、この反応は不可逆と考えられており、
神経細胞でのみ記録されています(64)。
これは微小管の寿命を上げる効果があり(65)、
シナプスを安定的に保つうえで重要かもしれません。

アセチル化: 
α-チューブリンのリシン40にアセチル基を付加する修飾。
この修飾は、微小管の内部からしかアクセスできないリシンで起こるため、
酵素がどのようにこのリシン残基にアクセスするかは不明です。
哺乳類では主要なアセチル化酵素がATAT1であることが判明しています(66)。
一方、逆反応はHDAC6によって触媒されることが知られています(67)。
アセチル化が微小管の構造や機能に与える
実際の影響はまだ解明されていません(68)。

ポリグルタミル化: 
グルタミン酸ポリマー(通常4～6残基(69))をα-チューブリン末端付近の
5つのグルタミン酸のγ-カルボキシル基に付加する修飾です。
TTL関連酵素が初期の分岐グルタミン酸を付加し(TTL4、5、7)、
同じファミリーに属する
他の酵素がポリグルタミン酸鎖を伸長します(TTL6、11、13)(70,71)。

ポリグリシル化: 
グリシンポリマー(2～10残基)をβ-チューブリン末端付近の
5つのグルタミン酸のγ-カルボキシル基に付加する修飾です。
TTL3および8が初期の分岐グリシンを付加し、
TTL10がポリグリシン鎖を伸長します(71)。

その他
- リン酸化
- ユビキチン化
- SUMO化
- パルミトイル化
これらが微小管転写翻訳後装飾で生じることが知られています(58)。


微小管関連タンパク質(Microtubule-associated proteins)(以下、MAPs)は、
in vivoにおいて微小管の動態を調節する上で
重要な役割を果たすことが示されています。
- 微小管の安定化(※)(72)
(※)微小管の重合速度、脱重合速度、カタストロフィー(急激な崩壊)。
- 他の細胞骨格との結合架橋(72)
- 他の細胞骨格を含めた安定性
- 物質輸送(73)

脳組織から最初に同定されたMAPsは、
分子量に基づいて2つのグループに分類されます。

第一のクラス:
分子量が55-62 kDa以下のMAPsであり、これらはτ(タウ)タンパク質と呼ばれます。
in vitroでタウタンパク質は微小管に直接結合し、核形成を促進し、
解体を防ぎ、並行配列の形成を誘導することが示されています(74)。
さらに、タウタンパク質は軸索内の微小管を安定化することが示されていますが、
タウたんぱく質の蓄積はアルツハイマー病の代表的な病理の一つです。
問題となる理由は、脱リン酸化酵素の働きの低下により
異常なリン酸化状態のタウたんぱく質が増え、
この異常な構造は微小管との結合性が低下します。
結果として、神経細胞の微小管の構造安定性が低下します(75)。

第二のクラス:
分子量が200-1000 kDaのMAPsであり、
MAP-1、MAP-2、MAP-3、MAP-4の4種類が知られています。

MAP-1タンパク質: 
A、B、Cの3つの異なるタンパク質から構成されており、
このうちCタンパク質は小胞の逆行性輸送において重要な役割を果たし、
細胞質ダイニンとしても知られています。

MAP-2タンパク質: 
樹状突起および神経細胞体に存在し、
他の細胞骨格フィラメントと結合します。
神経細胞の軸索の発達に関わり(76)、
軸索の変化が成熟すると発現が低下します。

MAP-3たんぱく質:
熱に対して安定性の高いたんぱく質です。
グリア細胞の機能に関与する可能性があります。
また、成熟神経細胞でみられる
ニューロフィラメントが豊富な軸索で発現が観られます。
MAP-3はここで局在しているため(78)、微小管を
ニューロフィラメントリッチな軸索に配置させる機能。
これがあるかもしれません。
そのほか、肝臓、心臓、脾臓、副腎、腎臓などでも
限定的な細胞で発現がみられることがあります。
例えば、腎臓では有足細胞(podocyte)で見られます(77)。

MAP-4タンパク質: 
大部分の細胞に存在し、微小管を安定化させます。
キネシンモーターの活性を制御することで
細胞内小器官の配置を制御する機能があります(79)。

微小管構造を安定化させるMAPsに加えて、
他のMAPsは微小管を切断または脱重合を誘導することで
不安定化させる効果を持ちます。
katanin、spastin、fidgetinという3つのタンパク質は、
Microtubule-severing enzymesとしての微小管の強い成長因子です(80)。

MAPsは、軸索と樹状突起の異なる細胞骨格の形態を決定する因子であり、
樹状突起では微小管が軸索よりも離れた位置に
配置されていることが示されています(81)。


プラス端追跡タンパク質(+TIPs)は、
微小管の成長するプラス端に結合するMAPタンパク質であり、
微小管動態の調節に重要な役割を果たします。
- 古い細胞骨格からの迅速な脱離
- ＋端への物質輸送
- たんぱく質の局在化(to 細胞皮層、キネトコア)
- 微小管構造の安定化
- アクチンとの連結(89:Fig.1)
従って、細胞分裂、運動、形態形成において重要な役割を果たします(82)。

+TIPとして最初に同定されたMAPは
CLIP170(細胞質リンカータンパク質)です(88)。
微小管脱重合救済イベントにおいて役割を果たすことが示されています。
他の+TIPsは、
- EB1、EB2、EB3(83)
- p150Glued(84)
- Dynamitin(85)
- Lis1, CLIP170(86)
- CLASP1、CLASP2(87)
これらなどが含まれます。
この+TIPであるCLASPsは＋端で焦点接着に関連する
インテグリン細胞内ドメインに作用し、
インテグリンを含めて焦点接着を分解する働きがあります(92)。
従って、細胞の離脱、運動に関与しています。


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