mRNA治療を実現するためのmRNA構造最適化

mRNAワクチンの技術を使って
一般的な治療に応用する事を考えた場合の
一番のボトルネックは
必要なたんぱく質の量と維持時間が
異なるということです。
従って、
タンパク質を多く、長い時間
安定的に標的細胞で生み出す必要があるので
その為の要素技術を積み上げていく必要があります。
ナノ粒子の標的化だけではなく
mRNAの構造自身にもタンパク質を
効率的に生み出すための技術的介入余地は多くある
とされています。
Eduarde Rohner, Ran Yang, Kylie S. Foo, Alexander Goedel & Kenneth R. Chien
(敬称略)は
mRNAのタンパク質の生産効率を上げるための
要素技術について総括されています。
その内容に
上の背景、考察を加えて
読者の方と情報共有したいと思います。

mRNAの本来持つ免疫原性は
ワクチンとしての効果を増加させますが、
治療としてそれを利用する事を阻害します。
なぜなら
治療は高いタンパク質発現量を必要とするからです。
酵素補充などの応用に対するマウスのモデルでは
局所化した再生治療や癌治療においては
mRNAワクチンに対して
50倍から1000倍程度の高いmRNA用量が
典型的には必要であるとされています(2-24)。
高いレベルでのタンパク質発現の必要性は
自然免疫反応を最小化させるために
mRNA安定性をあげるために
転写効率を最大化させるために
mRNA輸送媒体を最適化するためのの
いくつかの戦略を誘導します。
mRNA輸送媒体の特性は
送達システムに関連して考えられなければなりません。
例えば、
投与方法は直接的なのか？全身性なのか？
対象物のタンパク質の生理の様式はどうか？
これらなどです。

//mRNA輸送媒体//ーー
mRNAの構成要素
〇The cap
〇5' and 3′untranslated regions (UTRs)
〇Open reading frame (ORF) 
〇Polyadenylated (poly(A)) tail
これらはタンパク質発現を強化するために
最適化する事ができます。
5′ cap analogs and 3′ poly(A)は
エクソヌクレアーゼ防御を通した
mRNAの安定性、転写効率
リボソーマル複合体への触媒効果を
最大化させるためにデザインされます(25-29)。
The poly(A) tail length (100–300 nucleotides)。
これの最適化は
与えられたmRNAの合成能力の均衡状態を整える上で
非常に重要です(27,29)。
向上した5'cap analogsは転写効率を向上させるだけではなく
Capping効果を向上させます。
試験管の中では70%から95%に向上しています(25,30)。
3′and 5′UTRの構成は
標的細胞のためカスタマイズすることができます。
それが転写の効率と組織特異性を向上させる事ができます(28,31,32)。
現在、ほとんどのmRNA生産は
α-globin、β-globinからの
合成UTRシーケンスを含んでいます(31-33)。
UTRの最適化はタンパク質発現を
数倍向上させる事ができます(34,35)。
標的に対する注意深いスクリーニングや
カスタマイズが広範な改善を導きます。
それは標的細胞や病変部位微小環境のために仕立てられた
mRNAがタンパク質生成のために転写される効率を
最大化させることを可能にします(34-37)。
--
mRNAワクチンや治療の最も重要な発展は
化学的修正されたヌクレオチドの導入が
試験管、生体内でトランスフェクションされた後
タンパク質発現を顕著に上昇させる
という発見にあります。
これえまでの
最も新しいRNA製法の化学的な修正は
その特性を決める上で中心的でした(38,39)。
130以上の自然発生的なRNA化学的修正が
これまで報告されています(40,41)。
methylpseudouridineの対象
他の修正されたヌクレオチドの対象は
自然免疫系のトール様受容体による検出を
顕著に減らすために中心的な事です。
結果として
修正されていないmRNAと比較して
生体内でのタンパク質発現を上昇させます(42-46)。
生体内送達、mRNA純度の
異なるタイプの化学的修正、キャリア、方法の組み合わせは
驚くべき多様な効果を導きます。
それは最適化のための付加的な余地があるかもしれません(47,48)。
他の多くのRNA化学的修正の特徴と効果は
まだ十分には明らかにされていません(41)。
ヌクレオチド全体から部分的な入れ替えにシフトすることで
さらなる改善が見込めるかもしれません。
自然発生的なmRNA修正は
そのように部分的かつ異種的に修正されているからです(45,47)。
--
mRNAウジリン内容物は自然免疫の活性化に
大きな影響を与えます。
この見識を使って、
臨床的に効果のある非修正のmRNAワクチンは
免疫を逃れ、転写効率を向上させるために
生みだされました。
これは修正されたmRNAワクチンと同様です(47)。
最適なコドン構成要素の分子的な理解は
近い将来において
臨床的に効果のある非修正のmRNAの治療の
生成を促すためのコドン最適化アルゴリズムを
捉える可能性があります(49-51)。
--
タンパク質発現の強化に加えて
慢性疾患のmRNA治療の主な制限要因は
タンパク質生成が比較的短い時間しか維持しない
というです。
従って、安定的にタンパク質生成を行うためには
繰り返しそれを送達させる必要があります。
上で述べた免疫刺激、タンパク質発現問題に対する
mRNA構造的最適化に加えて
タンパク質発現持続時間の向上のために
いくつかのアプローチがあります。
Self-amplifying mRNAs(saRNAs)は
RNAαウィルスの自己増殖を使います。
それは細胞質でRNA転写を増幅させます。
しかし、
対象となる遺伝子の
ウィルス構造的子ど遺伝子を入れ替えます(52-55)。 
saRNA転写複製は発現動力を延長させるので
輸送頻度を減少させることによって
酵素補充治療に対して適しています(53)。
このアプローチは
タンパク質発現を上昇させ
他のmRNAに対して10倍少ない量で
同じ量のタンパク質を発現させることができます。
従って、今生体内で試験され
ワクチン生産のための大量生産のための
生産技術の検討が行われています(53-55)。
またsaRNAはmRNAs全体のサイズを小さくすることにも
貢献します(56,57)。
--
従来のlinear mRNAのもう一つの代替は
circular mRNA (circRNA)です。
RNA’s loose endsの折り畳みは
circRNAを酵素の分解から守ります。
それによってトランスフェクトされたHEK293細胞で
RNA寿命が2倍拡張しました(58-60)。
長寿命化はタンパク質発現の強化なしに
トータルのタンパク質の発現量を
上昇させることができます(58-60)。
circRNAは
コスト的な5'キャップと
扱いにくい3′ poly(A) tailを
避ける事ができます(59,60)。
環状化は化学的な入れ替えなしに
RIG-1やトール様受容体認識を強く減らすことができます(58,59)。

//RNA純度化//ーー
mRNAの試験管内での合成は
望まない副生成物が生じます。
例えば
double-stranded RNA (dsRNA), uncapped mRNA or mRNA fragments.
これらなどです。
これらの副生成物は
強くmRNAトランスフェクションを干渉し、
自然免疫系を活性化させます。
またトータルのmRNA輸送媒体の過剰評価を導きます(61)。
液体クロマトグラフィがmRNA生産物の純化のために
使用されます。
セルロース純化、アニオン交換、水素結合などが
類似した目的の為、発展されてきました(61,62)。
化学的修正のある、ないmRNAに対して純化を行った場合
human EPOは400%, 30%それぞれ上昇しました(46,48)。
これは不純物を取り除くことの重要性を示唆する
データです。

//考察//ーー
タンパク質を効率的に生み出す介入余地は多く
現時点の量よりも桁で多くのタンパク質を
生みだす可能性が残されています。
mRNA自身で効率を劇的に上げる事は
ナノ粒子による標的化のハードル、技術的負荷を
下げる事にもつながります。

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