mRNA治療の為の輸送媒体パッケージ技術

mRNAは不安定で分解されやすいので
分解酵素から構造を守るための
パッケージ、送達システムを必要とします。
また、そのことは
効率的な細胞取り込み、
効率的な細胞内での放出、
効率的なタンパク質への転写を可能にします。
そのパッケージ技術のほとんどは現状では
脂質ナノ粒子であり、
それが最初に発表されたのは60年前です(2)。
脂質ナノ粒子は今まで
様々な改変や発展を経験し、
その軌跡の中で
small interfering RNA(siRNA)の送達における
最初の臨床的使用を可能にしました(3,4)。
一方で、
細胞、細胞外小胞、生体模倣小胞(biomimetic vesicles)に
基づくパッケージ技術は現在進行形で発展しており、
脂質ナノ粒子の代替のアプローチとして
臨床前の研究で効果が確かめられています(1)。
--
Eduarde Rohner(敬称略)らは
mRNA治療実現の一つの鍵である
送達媒体パッケージについて総括しています(1)。
その内容と意見について
読者の方と情報共有したいと思います。

//脂質ベースパッケージ//
RNAが積載されている脂質ナノ粒子の現在の型は
1960年代に生まれたリン脂質ベースリポソームの
派生型です(2)。
脂質ナノ粒子は4つの鍵となる要素からなります。
構造的脂質(Structural lipids)、コレステロール、
陽イオン性脂質、ステルス脂質です。
構造的脂質は脂質ナノ粒子の
基礎的な足場(scaffold)で
主に中性のリン脂質です。
任意の比率でコレステロールを加える事は
脂質ナノ粒子を安定化させます。
それによって
被膜の流動性、弾性、浸透性のような
物理的な特性を変化させることができます(5-7)。
陽イオン性の脂質は
脂質ナノ粒子内に静電引力によって
陰イオン性を持つRNAなどの核酸を積載する際に
必要とされます(8,9)。
しかしながら、
陽イオン性の脂質を加える事は欠点があります。
陽イオン性の脂質は
細胞毒性、細胞膜タンパク質のオプソニン化
低いトランスフェクション効率を誘発します。
それにより、
副作用に繋がる受け細胞へのダメージや
食細胞による取り込み、
脾臓、肝臓などによるクリアランスなどが生じます(10-13)。
それゆえに
集中的な努力が生理化学的性質を修正するために
行われてきました。
その結果として
脂質ナノ粒子の免疫原性を顕著に減らす事ができる
pH感受性のある陽イオン脂質。
(pH-sensitive ionizable cationic lipids)
これが発見されました。
つまり、pHによってイオン性が変わる
脂質のことです。
Ionizable陽イオン性脂質は
循環器の中で電荷中性なので、
細胞や分子の認識から逃れることができます。
エンドソーム経路によって細胞内に取り込まれた後
それらはイオン化され、
エンドソーム被膜と融合します。
そして、内容物である
mRNAが細胞質中へ放出され、
その後、タンパク質に翻訳されます(14,15)。
様々なionizable脂質が今まで開発されました。
2012年に報告されたものは
DLin-MC3-DMA(MC3)脂質です(16-19)。
MC3からなる脂質ナノ粒子の
Median effective dose(ED50)は
マウスや猿で
従来の王道として使われていたionizable脂質KC2に対して
20倍低いとされていました。
つまり、効果が確認されるために必要な
注入ナノ粒子は20倍少なくともよく、
それによって
免疫原性も含め様々な副作用のリスクを
潜在的に下げる事ができることを意味します。
実際にこの顕著な改善は
2018年のsiRNA Onpattroの
最初の臨床の送達システムの実現、
それの承認に貢献しました(3,4)。
現在、普及しているCOVID-19 mRNAワクチンの
脂質ナノ粒子は上述したMC3類似物を使用しています。
これは脂質の毒性や生物分解性において
改善がみられたものです(19,20)。
--
ステルス脂質はPEGポリマー複合体脂質であり、
免疫原性を減らすために脂質ナノ粒子の
構成要素として加えられました。
PEGsは液体内のナノ粒子のコロイド安定性を
高めるために使われます(21-24)。
これは生理学的に不活性で
様々な受容体の結合部位を避けることができます。
凝集やオプソニン化を減らすこれらの特性は
免疫原性を減らし、生体内での保持時間を向上させます。
それにより安全で効果的な投与が可能になります(21,25,26)。
さらに興味深いことに
PEGylated脂質ナノ粒子は
小さく、かつ均一な脂質ナノ粒子の製造を促進します。
その直径は50～100nmです。
この大きさのナノ粒子は
免疫システムの活性化から逃れられる可能性があります(25,26)。
他方で、
PEG過感受性に関する問題が
治療の為の慢性的な投与に対する
PEGylated脂質ナノ粒子の利用性を制限します(21,27,28)。
現在の研究では
PEGylated脂質ナノ粒子の最適化
異なるステルス脂質の発展に焦点が当てられています。
例えば、
Polysarcosine複合体脂質です(29)。

//細胞ベースパッケージ//ーー
脂質ナノ粒子の代替として
細胞のような生物送達小胞の利用があります。
標的細胞へmRNA積載物を送達させるよりも
このアプローチは
生体外で細胞内でRNAから生産された
タンパク質を細胞が持つ傍分泌の機序を
利用するものです。
合成脂質ナノ粒子と比較した時の利点としては
生物互換性が高い、
循環器での寿命が長い
内的な細胞内、細胞外信号を利用できる
ということが挙げられています(30,31)。
細胞は酵素、薬剤、脂質ナノ粒子の送達媒体として
使用する事ができます。
カスタマイズ化は
mRNAを様々な細胞種の中に入れることによって
広範な範囲で出来る可能性があります。
例えば、免疫細胞、血液細胞、間葉系細胞です。
また、それらの細胞を
遺伝子的にエンジニアリングする事も可能です(30-34)。
このアプローチは
望ましい治療、薬理効果を際立たせるための
細胞治療と組み合わせることができます。
しかしながら、
mRNA治療の細胞ベース輸送は
一般的な細胞治療適用と同様の注意点によって
制限されます。
ドナーハロタイプ互換性
均一的な生産
質の制御
細胞内への輸送効率。
これらの4つの課題によって制限されるかもしれません(35)。
また、細胞自身が癌化する可能性もあります。
--
2019年、Eduarde Rohner(敬称略)らは
修正されたmRNAコーディングVEGFを生体外で積載した
皮膚線維芽細胞を注入する事で
筋肉内のVEGFの輸送に成功したことを
マウスのケースで報告しています(36)。
虚血肢の血管密度が上昇することで
組織の壊死を顕著に減らす事に成功しています。
そのフォローアップ研究として同じように、
今度は間葉系幹細胞で
VEGFやBMP-2を輸送する研究をしています(34)。
治療を受けたマウスは
骨形成や血管形成が改善したことが
示されています(34)。
間葉系幹細胞、好中球、単球、赤血球を使った
mRNAやタンパク質積載物の輸送についても
他の研究で示されています(30-33,35)。

//細胞外小胞ベースパッケージ//ーー
もう一つの新手のアプローチとしては
輸送媒体として細胞外小胞を使う事です。
細胞外小胞はいくつかの亜型を含みますが、
ほぼすべての細胞種から放出されます(37)。
今述べた様に
細胞外小胞は亜型を含み
そのサイズ、細胞内の生成過程によって分類されます。
エクソソームは、50-150nmの直径を典型的にもつ
細胞外小胞で、エンドソームから放出されます。
ドナー細胞から放出された
エクソソームは脂質ナノ粒子と同様に
エンドソームを通じて受け細胞で取り込まれますが
内容物の全てが細胞質に放出されるわけではなく
他の細胞へそのまま放出されることもあります(1)。
微小胞は50-500nmの大きさで
細胞膜からそのまま萌芽して放出されます。
アポトーシス小体は1μm以上で
細胞がアポトーシスした際に放出されます。
--
細胞外小胞は細胞間のコミュニケーションの役割を
果たしますが、その一部の機能として
様々な内容物の送達を行います。
細胞の代謝生成物、単鎖の核酸、
フル長さのmRNAやタンパク質などです(37-39)。
細胞外小胞を輸送媒体として利用する際には
高い生体互換性、低免疫原性などがあります(40)。
バイオマーカーとしての診断における応用も含めて
癌治療や心臓血管疾患治療に対して
細胞外小胞の免疫修正や
積載物輸送能力について詳しく調べられています(41.42)。
--
細胞外小胞はドナー細胞、親細胞の性質を引き継ぐ
という性質があります。
例えば、血液細胞由来の細胞外小胞は
全身性の投与をしたときには
血液脳関門を通過できる能力を有しています(43,44)。
間葉系幹細胞由来の細胞外小胞は
間葉系幹細胞が持つ機能と同様に
向炎症性作用や傍分泌特性を持っています(45,46)。
臨床前研究では
様々な細胞種からの細胞外小胞は
毒性を誘発せず、
繰り返しの投与に対する副作用も許容できる
とされています(47)。
細胞外小胞は特異的送達の為に
エンジニアリングできる潜在性を持っています(48,49)。
基本的な課題は
純度の高い性質の揃った細胞外小胞を得るための
分析、分離、純化プロセスにあります。
異なる分離方法が包括的に実験されています(50-52)。
また、付加的な課題としては
効率的な内容物の積載にあります。
積載方法としては
電気穿孔法、
超音波処理、
Extrusion、
統計融解サイクル
これらなどが挙げられています(1)。
近年、いくつかのアプローチが
前段階の積載の特異性を上げるために報告されています。
mRNAとタンパク質を認識するタンパク質
ARRDC1を使用する事に寄って
AARDC1仲介の微小胞の特異的かつ効果的な
積載を促進しています(53)。
ウィルス様の粒子のような非典型の細胞外小胞によって
特定のモチーフ含むmRNAの好意的な取り込みを
可能にする技術があるとされています(1)。

//生体模倣小胞パッケージ//ーー
生体模倣小胞とは合成ナノ粒子と生物学的なそれを
組み合わせたものです。
細胞膜でコートされ、
金、シリカ、脂質ナノ粒子、ポリマーなどの
ナノ粒子が内包されます(54)。
コートをすることで
合成ナノ粒子の免疫原性を緩和することができます。
そのコートは
赤血球、血小板、
免疫細胞、幹細胞、
癌細胞、間葉系幹細胞。
これらなどが挙げられています(55-62)。
この生体模倣小胞は
製造の制御性が高く、
脂質ナノ粒子の安定的な貯蔵能力を持っています。
一方で、生体互換性や標的特異性もあります(63,64)。
現状では有望な選択肢の一つですが、
また研究段階としては黎明期で、
詳細な物理、機械的な見識についてはまだわかっていません。
エクソソームとポリマーの配合は
循環器での安定性は高く
高い貯蔵能力と薬理特性を持っていた
という報告もあります(65)。
合成ナノ粒子や細胞外小胞が持つ欠点を
補う事ができる選択肢の一つになるかもしれません。

//意見//ーー
合成ナノ粒子は60年の歴史があり、
実際に臨床試験で認可された実績もあります。
現在、普及している新型コロナウィルスワクチンで
使われた脂質ナノ粒子も
今までの研究の成果が大きく貢献している
ということです。
安定性した製造性や
新型コロナウィルスの世界的流行による
急速な需要に対して製造ラインを大幅に増強したことで
コスト競争力が高くなっていると考えられます。
一方で
細胞はCAR免疫療法などの細胞医療などと
技術的なつながりはあると考えられますが、
価格が非常高いというデメリットもあります。
細胞外小胞は
本当に安定的な製造ができるか？
そもそもそれを評価する基準がまだ定まっていない
ということから
これから様々な実績が積み上げられていく中で
その利点が生かされるものであると考えられます。
生体模倣の小胞と合わせて、
合成ナノ粒子や細胞医療では
解決しきれない領域において、
あるいは改善の余地が残されている領域において
適用の可否が市場の原理も含めて
決まっていくと考えられます。

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