細胞外小胞の課題であるコロナ形成について

細胞種特異的輸送系統
(Cell-type-specific delivery system)。
これでボトルネックとなっているのが
仮に質の良い、特異的親和性の高い装飾因子を
ナノ粒子や細胞外小胞の表面に
装飾できたとしても、
その結合部位が標的細胞まで
無傷、露出の状態で保持されるか？
ということです。
病変部位の組織までは
局所投与の場合を除いては
特に人の場合は距離がありますから、
その経路で体内にある様々な物質と相互作用して
本来の構造がどんどん改変されてしまいます。
血液の状態は
人それぞれ違いますから、
小胞性薬剤そのものの偏差だけではなく
表面に形成されるコロナの状態も大きく変わってしまいます。
精密医療を目指しているはずが
様々な偏差によって
精密医療の観点で見た時の有意性が
十分に示されないということも想定されます。
従って、
各段階ごと、事実を確認して
一つ一つ丁寧につめていくしかありません。
しかし、
細胞外小胞は体内にある生理機序を利用するものなので
その体内に備わっているものを教科書として
そこから学ぶことによって
何らかのヒントが得られることもあると推測されます。
逆に体内にあるものを利用するからこそ
裏の側面として
合成ナノ粒子よりもコロナ形成などにおいて
難しさがあるという事です。
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Edit I. Buzas(敬称略)は
コメントして細胞外小胞の問題と解決策について
最新の情報を上梓されています(1)。
その内容の一部を参照し、
独自の調査、考察を加えました。
その内容について
読者の方と情報共有したいと思います。
その中で日本でも指摘されている様に
様々な難しさのある細胞外小胞を使った医療の実現に向けた
小さな一歩に今日も貢献できればと考えます。

//内容、考察//ーー
細胞外小胞は全ての細胞から放出され、
細胞間のコミュニケーションや
生体内の恒常性プロセスにおいて重要な役割を
担っています(1)。
細胞外小胞の特徴は
リン脂質の2重層を持つことです。
その構成要素である脂質の構成比率は
放出されるドナー細胞の細胞型によって異なります。
また、リン脂質2重層の表面には
膜貫通型のタンパク質を含みます。
代表的なのはテトラスパニンです(2)。
数十年の間、細胞外小胞の分野で従事している
研究者は細胞外小胞から
コンタミネーションとして固着している
タンパク質やリポタンパク質を分離する事に
多大なる努力をささげてきました。
しかしながら、
この分離はその努力にもかかわらず
実現していません。
従って、正味の細胞外小胞の精製は難しい状況です。
特に、血中などタンパク質を多く含む溶液から
細胞外小胞を抽出する際には
固着している余分な物質から分離する事は
非常に困難であるとされています(2)。
--
現在、この問題に対して、
細胞外小胞の周りのタンパク質コロナの
自発的な形成を検出する事に研究がシフトしています(3-6)。
細胞から放出された細胞外小胞の
外側に分子を検出することです。
このようなコロナは
以前は細胞外小胞の準備において
コンタミネーション、余計なモノ
であると考えられていました。
重要なのは
このコロナは細胞外で吸着するものもあれば、
細胞内で細胞外小胞の前駆体が生成される経路で
付着するものもあります。
これらはコロナではありますが、
機能的に重要であるかもしれません(7)。
粒子が
細胞外の空間でタンパク質コロナを引きつける事は
すでに合成ナノ粒子で長く知られています。
同じく細胞外小胞の周りに吸着した
タンパク質コロナは
合成ナノ粒子やウィルスの周りに吸着した
コロナを分析するよりも難しいのが一般的です。
なぜなら、
細胞外小胞の細胞膜に貫通しているタンパク質や
遺伝子的に「正規のルートで」発現した
タンパク質は生体内に存在するものであり、
それとの類似物も同じく生体内に存在し、
コロナとして取り込むことがあるので、
両者の見分けが構造上つきにくいことが挙げられます。
例えば、
エクソソームの周りにインテグリンが
膜貫通タンパク質として発現しているケースがありますが、
その同じタイプのインテグリンが、
「遊離した状態で」細胞内外に存在して
それがエクソソームの表面に固着すると、
構造上、両者の区別がつきにくいということです。
ナノ粒子の場合は、
人工的に表面リガンドを形成するため、
生体内にあまりない構造を選択する事ができます。
細胞外小胞の場合はそれを避ける事は
原理的に難しいです。
↓
例えば、細胞外小胞の場合であっても
膜に貫通している場合と、コロナで吸着している場合では
剥がすために必要な最低限の力が大きく異なる
可能性があります。
その力をの差を利用して
コロナだけを選択的にはがす事は出来ないでしょうか？
--
上述した同じ物質を引き付けてしまう問題は
血漿フリーの体液で細胞外小胞を発生させる事で
一部、回避できうるとされています(3)。
実際に前述したように
コロナを分析する解析手法はいくつかあります。
〇Immunoblotting, mass spectrometry, 
〇Nanoparticle tracking analysis (NTA) 
〇Tuneable resistive pulse sensing, 
〇Confocal and super-resolution microscopy, 
〇Transmission and immune electron microscopy, 
〇High-resolution flow cytometry, 
〇ELISA 
〇Single-particle interferometric reflectance imaging sensor detection. 
これらです。
また、
〇細胞への取り込み
〇増殖能力
〇細胞死の導入
〇遺伝子発現
〇オートファジー
〇老化
〇代謝
〇分布、移動
〇創傷治癒
〇血管生成
これらを含む機能分析において
コロナの影響を調べる事もできます。
--
細胞外小胞のコロナは
合成ナノ粒子やウィルスの周りに形成される
コロナを含みます(3)2。
これらの「共通の」コロナタンパク質は
血漿中の豊富なたんぱく質です。
例えば
アポリポタンパク質、免疫グロブリンです。
アポリポタンパク質は両親媒性の分子で
脂質の周りに吸着する能力を持ちます。
免疫グロブリンが細胞外小胞の周りに吸着する
機序は正確にはわかっていません。
合成ナノ粒子と細胞外小胞のコロナの違いはあります。
膜受容体を介した特異的な相互作用や
その他、糖たんぱく質、糖脂質、糖結合タンパク質の
間の相互作用は典型的には
細胞外小胞のケースだけでしか起こりません。
つまり、
細胞外小胞の膜表面に突出している
受容体や表面リガンドがコロナの引きよせに
関与しているという事です。
↓
これは細胞外小胞が特定の細胞への標的性が高い事が
裏目に出ているとも言えます。
意図しない相互作用によって、
作用させたい機序とは異なる余計な物質が
それら受容体やリガントと結合してしまうという事です。
細胞種特異的な設計をした細胞外小胞を
「そのままの状態で」親和性を落とさず
標的細胞、組織まで輸送する事の難しさが想定されます。
--
特定のコロナは細胞外小胞の外表面に沿って
均一に分布します。
そして「Patchy corona」を形成します。
また大きく凝集したタンパク質複合体も
細胞外小胞の表面に吸着します(3)。
いくつかの手法による分析によると
タンパク質コロナは平均して5.3±0.3nmの厚みを持ち、
10-20nm厚さの水和シェルで覆われています(8)。
--
細胞外小胞へのコロナ形成のいて
チオール相互作用が関わっています。
アルブミン、ウロモジュリン、フェブリノゲンが
細胞外小胞のプラズマ膜に結合します。
これらのタンパク質は
35, 48, 58システイン残基を含みます(9)。
これらは血漿中、尿中に含まれます(3,9)。
静電気的な相互作用も関与するかもしれません。
負に帯電したタンパク質が
細胞外小胞の表面や
糖たんぱく質、糖脂質、プロテオグリカンなどの
表面リガンドと静電気的に結合します。
このプロテオグリカンは
〇Syndecan-1 (SDC-1)
〇Glypican 1 (GPC1) 
〇Betaglycan
これらが含まれます(10)。
カルボキシレート基やО-、Ｎ-硫酸塩は
プロテオグリカンにポリアニオン的な性質を与えます。
これによって、
400種類のヘパリン結合タンパク質と
相互作用する能力を獲得します(11)。
ヘパリンは凝固に関係する物質で
血中に多く含まれるので、
それによって結合するコロナの多様性が向上します。
これらのヘパリン結合タンパク質は
〇成長因子
・Acidic fibroblast growth factor
・Basic fibroblast growth factor
・Hepatocyte growth factor, 
・Vascular endothelial growth factor 
・Platelet-derived growth factor
〇サイトカイン、ケモカイン
・CXCL8、TGFβ、CXCL12、CCL5
〇酵素阻害物質
・Heparinases 1 and 2 
・Thrombin
〇リポタンパク質
・Low-density lipoprotein (LDL)
〇その他
・Annexin A5 
・Annexin A2.
これらを含みます。
LDLコレステロールとプロテオグリカンの
静電気的な相互作用は
タンパク質表面パッチでクラスター化した
apoB-100内の塩基性アミノ酸によって
仲介される事が知られています(12)。
↓
細胞外小胞を薬剤輸送媒体として利用する事を考えた場合
少なくともその経路において血中が含まれる場合においては
血液の患者さんごとの形質が
大きく輸送特性に影響を与えうることを示しています。
例えば、LDLコレステロール値が高い人とそうではない人、
男性と女性、年齢によって
対象とする疾患は同じでも
薬剤輸送効率が経路で結合するコロナ形成が大きく変わる事に
よって変わる可能性があります。
これは合成ナノ粒子よりも偏差が大きいかもしれません。
--
上述したように細胞外小胞の表面リガンドは
コロナとの相互作用因子ですが、
実際にTNF受容体やインテグリンに
結合するコロナが確認されています(10)。
--
好中球由来の細胞外小胞(CD63+CD66b+)は
細胞種特異的な細胞外で形成されたコロナを
形成します。
これはおそらく表面に突出している
タンパク質の種類が特異的であるからである
と考えられます。
好中球の脱顆粒化の間
静電気的な相互作用を通して
分泌された好中球エラスターゼに関連する
細胞外小胞や
細胞外小胞に結合した酵素が
αl-antitrypsinに抵抗性を持ちます。
--
血漿に誘導されたコロナの構成物質の間で
予想外に広範にタンパク質とタンパク質の相互作用
ネットワークが生じる事が
STRINGデータベースによって確認されています(3)。
細胞外小胞は細胞外小胞の表面の周りの
相互作用性の高い多くのタンパク質からなる
ネットワーク形成を誘発します。
例えば、
ヘパリン、ヘパラン硫酸結合タンパク質があります(11)。
--
コロナ形成はタンパク質だけではありません。
DNA, RNA, 脂質なども含まれます(5,13)。
細胞外小胞によるDNA放出は
遺伝子毒性ストレスによって誘導されます(13)。
DNAにはジャンクDNAと呼ばれるものも含まれます。
フラグメント、切れ端のDNAが
細胞外小胞の表面において見つかっています(14)。
それは、細胞核にある染色体や
ミトコンドリア由来のDNAを含みます。
また、DNAとタンパク質が結合した複合体も
細胞外小胞のコロナとして形成されます。
塩濃度を上げた溶液で洗うと
細胞外小胞からDNAを取り除くことが可能です(13)。
しかし、こうしたDNAの切れ端を
エクソソームが輸送する能力を持つことは
生理学的上、必ずしも障害とはならず、
必要で有る可能性があります。
細胞内から余分なDNAを廃棄する役割があるからです。
RNAに関しては
表面にあるリポタンパク質がコロナとしてのRNA輸送と
関連する事が示唆されています(15)。
--
コロナを見分ける方法は
トポロジー、表面モフォロジー、表面形状、表面形態
などの幾何学的な情報から得られることもあります。
また、膜貫通ドメインの有無を調べる事で
識別できる可能性があります。
また、
グリコシダーゼ、サルファターゼは
グリカンや硫酸塩基を細胞外小胞から
取り除くことが可能です。
また、
前述したように塩濃度の高い液体で洗浄することで
静電気的に結合しているコロナを
取り除くことができます。
EDTAはカルシウムイオン依存相互作用を
減らすことができます。
Tween-20はタンパク質同士の相互作用を
小さくすることができます。
還元剤は二硫化結合を外すことができます(9)。
高速の遠心分離機で
機械的にコロナタンパク質を剥がすことができます(6)。
これは上述した考察で提案したように
おそらくコロナ形成している物質は
膜貫通している物質よりも吸着力が大きく低いので
遠心分離機で外側への力をうまく伝えることができれば、
コロナだけを剥がすことができる可能性があります。
少なくとも密度は小さくできるのではないかと考えます。
しかし、このように強いストレスをかけると
血管生成、皮膚の再生能力、
免疫改変等の機能を失ってしまう事が
挙げられています(6)。
また、新しいコロナ形成も指摘されています。
--
細胞外小胞を使った基礎実験や
今後想定される臨床試験などの結果において
厳格、かつ共通的なプロトコルを決める事は
データの誤解を防いだり、
再現性の問題を防ぐことにつながります。
同じドナー細胞由来の細胞外小胞でも
コロナ形成の違いによって
特性が大きく異なる可能性があるからです。
しかし、
こうしたプロトコルは
特に産業界では生産技術に関わる部分で
ある程度、秘密保持したい部分だと考えます。
知的財産の活用も含めて
情報開示のバランスも難しいところです。
--
細胞外小胞は直接、細胞膜から萌芽する
大きめのサイズのマイクロベシクルなどがありますが、
多胞体内で形成される
エクソソームの前駆物質である
腔内膜小胞においては
多胞体であるエンドソーム内の酸性度が高いため
コロナ形成が起こりやすいことが想定されています。
--
細胞外小胞は
抜き取る溶液や生成される溶液によって
コロナ形成が変わってきます。
特に血液や脳脊髄液では
コロナ形成が多く生じやすいとされています(1)。
--
特に閉経後の女性の乳がんでは
高コレステロール血症がリスク因子になると
いわれていますが、
癌の転移にも影響するという報告もあります(18)。
細胞外小胞とLDLコレステロールの凝集は
癌の転移ニッチにおいて重要な役割を果たす
と言われています(16)。
従って、
細胞外小胞と血中のコロナ形成の中で
コレステロールと相互作用し、
それによって腫瘍形成や転移に関わってる
という事が示唆されます。
特にLDLコレステロールはセロトニンを脳に輸送する
と言われています(要出典:日本2次情報より)。
従って、脳に走化性、向性を持っています。
実際に脳に転移した細胞外小胞は
LDLコレステロールと結合するという報告があります(19)。
逆に、LDLコレステロールを生かして
薬剤輸送において脳に細胞外小胞を
薬理機能を持たせて送るという事も考えられます。
脳への転移癌に対する治療に生かす
ことができるかもしれません。
実際に
こういったコロナ形成を生かす事も考えられています。
例えば、
Angiopep-2ペプチドでコロナ形成すると
LRP1受容体と結合し、
血液脳関門の浸透性が向上すると言われています。
従って、脳への細胞外小胞輸送効率が向上します。

//考察、提案//ーー
細胞外小胞を薬剤輸送媒体として利用する
1つの考え方は
「体がもつ自然な機序を利用する」というものです。
細胞外小胞は精緻なネットワークを築いていると考えられます。
例えば、
転移性の癌細胞は転移しやすい微小環境に
輸送されやすい細胞外小胞を放出すると考えられます(17)。
確かに、コロナ形成によって
そういった特異性の少なくとも一部は失われますが、
一定の走化性を残せる可能性は高いと考えられます。
「ネイチャーテクノロジー」
という分野があり、自然が持つ力から
その機能について学びましょうという考え方もあります。
細胞外小胞を分析する事によって
どうやって余分な物質が多い中で
一定の走化性、向性を獲得しているか
掴むことができるかもしれません。
また、
直感的なアイデアとしては
細胞外小胞の周りにできる表面リガンドの長さを
よく考えて設計するという指針もあります。
例えば、
コロナと多く相互作用する表面リガンド、受容体が
一番長く、最外周に来れば、
血中でコロナ形成することによって
細胞外小胞は蓋されてしまうかもしれません。
(逆にこれが良い可能性もあります。)
一方で、
逆にコロナと相互作用しにくい表面リガンドが
一番長く、最外周に来れば
全体的なコロナ付着を減らすことができるかもしれません。

(参考文献)
(1)
Edit I. Buzas
Opportunities and challenges in studying the extracellular vesicle corona
Nature Cell Biology (2022)
(2)
Théry, C. et al. J. Extracell. Vesicles 7, 1535750 (2018).
(3)
Tóth, E. Á. et al. J. Extracell. Vesicles 10, e12140 (2021).
(4)
Palviainen, M. et al. PLoS One 15, e0236439 (2020).
(5)
Yerneni, S. S., Solomon, T., Smith, J. & Campbell, P. G. Biochim. 
Biophys. Acta Gen. Subj. 1866, 130069 (2022).
(6)
Wolf, M. et al. J. Extracell. Vesicles 11, e12207 (2022).
(7)
Sung, B. H. et al. Nat. Commun. 6, 7164 (2015).
(8)
Varga, Z. et al. Colloids Surf. B Biointerfaces 192, 111053 (2020).
(9)
Santucci, L. et al. Sci. Rep. 9, 13048 (2019).
(10)
Buzás, E. I., Tóth, E. Á., Sódar, B. W. & Szabó-Taylor, K. É. Semin. 
Immunopathol. 40, 453–464 (2018).
(11)
Meneghetti, M. C. et al. J. R. Soc. Interface. 12, 0589 (2015).
(12)
Toledo, A. G. et al. J. Histochem. Cytochem. 69, 105–119 (2021).
(13)
Németh, A. et al. Sci. Rep. 7, 8202 (2017).
(14)
Lázaro-Ibáñez, E. et al. J. Extracell. Vesicles 8, 1656993 (2019).
(15)
Michell, D. L. & Vickers, K. C. Biochim. Biophys Acta 1861, 
2069–2074 (2016).
(16)
Busatto, S. et al. J. Nanobiotechnology 18, 162 (2020).
(17)
Ayuko Hoshino, Bruno Costa-Silva, Tang-Long Shen, Goncalo Rodrigues, Ayako Hashimoto, Milica Tesic Mark, Henrik Molina, Shinji Kohsaka, Angela Di Giannatale, Sophia Ceder, Swarnima Singh, Caitlin Williams, Nadine Soplop, Kunihiro Uryu, Lindsay Pharmer, Tari King, Linda Bojmar, Alexander E. Davies, Yonathan Ararso, Tuo Zhang, Haiying Zhang, Jonathan Hernandez, Joshua M. Weiss, Vanessa D. Dumont-Cole, …David Lyden
Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis
Nature volume 527, pages329–335 (2015)
(18)
Wen Liu, Binita Chakraborty, Rachid Safi, Dmitri Kazmin, Ching-yi Chang & Donald P. McDonnell
Dysregulated cholesterol homeostasis results in resistance to ferroptosis increasing tumorigenicity and metastasis in cancer
Nature Communications volume 12, Article number: 5103 (2021)
(19)
Sara Busatto et al.
Brain metastases-derived extracellular vesicles induce binding and aggregation of low-density lipoprotein
J Nanobiotechnology. 2020 Nov 7;18(1):162